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摘要
目的评估人胚神经干细胞(NSCs)移植在小鼠脑缺血模型中的作用,并探讨其联合使用免疫抑制剂对脑缺血模型疗效的影响。方法选用雄性清洁级C57B6/L小鼠50只,对动物进行标准饲养。造模前,对实验小鼠进行行为学评价,包括转棒实验和角落实验,小鼠在转棒仪上的运动时间≥300 s为完成了转棒实验测试,可纳入进行后续的实验;角落实验共进行10次测试,10次中连续3次未连续向左或右转向的小鼠为完成了角落实验测试,可被纳入进行后续的实验。用线栓法对完成行为学训练的C57B6/L小鼠制作脑缺血模型。造模术后72 h对实验小鼠进行头部MR T2加权成像检查,将梗死体积≥同侧半球20%的小鼠纳入实验。50只C57B6/L小鼠,排除未完成行为学训练2只、造模术后死亡6只、梗死体积<同侧半球20%17只,最终纳入25只小鼠,根据实验需要,将其完全随机分为人胚NSCs移植组(A组,8只)、环孢素A+人胚NSCs移植组(B组,9只)和脑缺血模型对照组(C组,8只)。实验所用的人胚NSCs来自解放军总医院第六医学中心妇产科孕12周自然流产的胎儿脑组织。造模成功后4 d,即人胚NSCs移植前3 d, B组小鼠经腹腔注射环孢素A,剂量为10 mg/(kg·d),连续注射至处死小鼠。造模成功后7 d,经A、B组小鼠脑实质内行立体定位注射移植人胚NSCs,移植位点分别选择缺血侧纹状体及缺血侧大脑皮质。移植后第1、4周,通过转棒实验、角落实验评价不同组小鼠的运动平衡功能。在小鼠造模后3 d及移植后第4周分别对其进行MR T2加权成像检查,并计算小鼠脑梗死体积。行为学评价及影像学评价完成后,灌注断头取脑行免疫荧光染色,以观察植入人胚NSCs的存活数量、分布以及分化情况。stem121抗体与4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)双阳性的细胞数量代表移植核心区域植入人胚NSCs的存活数量;stem121抗体与微管蛋白Ⅲ抗体作为混合一抗双染,其双阳性细胞提示植入人胚NSCs向神经元分化;stem121抗体与兔源性多克隆抗胶质纤维酸性蛋白(GFAP)抗体作为混合一抗双染,其双阳性细胞提示植入人胚NSCs向星形胶质细胞分化。结果 (1)A、B、C组小鼠于人胚NSCs移植后第1周转棒运动时间分别为(135±12)、(144±14)、(70±11) s,移植后第4周转棒运动时间分别为(150±16)、(161±17)、(101±17) s, 3组转棒运动时间的差异均有统计学意义(第1、4周的F值分别为86.03、30.04,均P<0.01),且A、B组转棒时间均大于C组,两两比较的差异均有统计学意义(均P<0.01),A组与B组的差异均无统计学意义(第1、4周的P值分别为0.128、0.180)。(2)A、B、C组小鼠于人胚NSCs移植后第1周角落实验右转次数分别为7.00(7.00,7.75)、8.00(6.50,8.00)、9.50(8.25,10.00)次,移植后第4周角落实验右转次数分别为7.50(7.00,8.00)、7.00(6.00,7.50)、9.00(8.00,9.75)次,3组右转次数的差异均有统计学意义(第1、4周的Z值分别为11.84、13.93,均P<0.01),且A、B组右转次数均小于C组,两两比较的差异均有统计学意义(均P<0.05),A组与B组的差异均无统计学意义(第1、4周的P值分别为1.000、0.797)。(3)A、B、C组小鼠于造模后3 d梗死体积分别为(167±19)、(172±22)、(170±21) mm3,A、B、C组于人胚NSCs移植后4周梗死体积分别为(120±21)、(85±12)、(144±24) mm3,3组造模后3 d与移植后第4周梗死体积的差值经对数转换后分别为(1.63±0.19)、(1.93±0.70)、(1.40±0.16) mm3,造模后3 d梗死体积差异无统计学意义(F=0.120,P=0.892),人胚NSCs移植后4周梗死体积差异有统计学意义(F=18.84,P<0.01),两两比较的差异均有统计学意义(均P<0.05),梗死体积差值的差异有统计学意义(F=28.77,P<0.01),梗死体积差值B组>A组>C组,两两比较差异均有统计学意义(均P<0.01)。(4)人胚NSCs移植后第4周,A、B组小鼠移植核心区域人胚NSCs细胞存活数量分别为(27 510±9 558)、(54 788±11 711)个,移植核心区域人胚NSCs细胞存活数量B组大于A组,差异有统计学意义(t=4.91,P<0.01)。人胚NSCs移植后第4周,免疫荧光染色显示,A、B组小鼠植入的人胚NSCs大部分停留在移植核心区域,少数向四周迁移;人胚NSCs细胞分化为神经元,呈黄色荧光;人胚NSCs部分分化为星形胶质细胞,呈黄色荧光。结论人胚NSCs移植治疗能改善小鼠缺血后的神经功能恢复,减少梗死体积,其联合使用免疫制剂可进一步减少梗死体积,并增加人胚NSCs的存活数量。
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单位安徽医科大学; 神经内科; 解放军总医院
