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摘要
目的:构建淋巴细胞活化因子3 (LAG3)-mCherry红色荧光蛋白的LAG3-mCherry慢病毒表达载体,转染HEK293T细胞获得稳定表达LAG3-mCherry融合蛋白的细胞系,探讨LAG3-mCherry融合蛋白在HEK293T细胞中的定位。方法:将LAG3质粒和带有mCherry的慢病毒载体分别用限制性内切酶Eco RⅠ和NotⅠ进行双酶切,构建pEZ-LAG3-mCherry表达载体。将测序正确的质粒利用Lipofectamine 3000转染HEK293T细胞,利用荧光显微镜观察LAG3-mCherry在HEK293T细胞中的表达定位,Western blotting法检测LAG3-mCherry融合蛋白的表达情况。结果:酶切鉴定结果,电泳后重组质粒双酶切后可见约为8 012和2 066 bp大小的2条DNA条带,与pEZ-Lv-mCherry载体及LAG3基因片段大小相符;DNA测序结果,LAG3基因成功插入到慢病毒表达载体中。荧光显微镜观察,LAG3-mCherry融合蛋白主要在HEK293T细胞膜上表达,少量蛋白滞留在细胞质中。Western blotting法检测,在转染pEZ-LAG3-mCherry质粒中检测到LAG3对应特异性条带。结论:成功构建了LAG3-mCherry慢病毒表达载体pEZ-LAG3-mCherry。通过稳定转染成功制备了稳定表达LAG3-mCherry的细胞系。LAG3-mCherry融合蛋白主要分布于HEK293T细胞的细胞膜上。
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