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摘要
目的探讨低氧预处理大鼠脂肪源性间充质干细胞(ADSC)条件培养基对全层皮肤缺损大鼠创面愈合的影响。方法 (1)取6周龄雄性SD大鼠1只, 颈椎脱臼处死, 分离双侧腹股沟脂肪组织, 胶原酶消化法提取第3代ADSC, 观察细胞形态后用于后续实验。取细胞, 采用随机数字表法(分组方法下同)分为成脂诱导组和成骨诱导组, 每组各6孔。成脂诱导组培养14 d观察成脂情况, 成骨诱导组培养28 d观察成骨情况。(2)取第3代ADSC, 分为常氧组和低氧组, 常氧组细胞置于氧气体积分数20%的常氧培养箱中培养, 低氧组细胞置于氧气体积分数2%的低氧培养箱中培养。常氧组培养3 h, 低氧组培养3、6、12、24、48 h, 分别取3个样本, 进行后续指标检测。实时荧光定量反转录PCR检测低氧诱导因子1α(HIF-1α)、血管内皮生长因子(VEGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPAR-γ)的mRNA表达量。收集2组细胞培养上清液, 离心过滤后获得常氧条件培养基(normo-CM)和低氧条件培养基(hypo-CM), 酶联免疫吸附测定法检测条件培养基中VEGF、转化生长因子β(TGF-β)、表皮生长因子(EGF)和胰岛素样生长因子(IGF)含量。(3)取27只6～8周龄雄性SD大鼠, 分为磷酸盐缓冲液(PBS)组、normo-CM组和hypo-CM组, 每组9只, 在其背部制作直径为1 cm的圆形全层皮肤缺损创面并分别滴加50 μL PBS、normo-CM及hypo-CM。伤后0、3、5、7、9、11 d, 观察创面大体情况, 测量创面面积并计算创面未愈合率。取创面组织, 苏木精-伊红染色观察伤后3、9、11 d创面炎症反应及伤后9 d创面再上皮化水平;Masson染色观察伤后11 d创面胶原沉积情况, 并分析胶原容积分数(CVF)。对数据行重复测量方差分析、单因素方差分析、t检验、Bonferroni校正。结果 (1)细胞融合度低时呈长梭形、贴壁生长、排列紧密。培养14 d, 成脂诱导组细胞经油红O染色后被染成红色的脂滴。培养28 d, 成骨诱导组细胞经茜素红S染色后可见红色结节。细胞鉴定为ADSC。(2)与常氧组比较, 低氧组细胞培养12、24 h HIF-1α mRNA表达量明显升高(t=5.43、5.11, P<0.05);培养6、12 h VEGF mRNA表达量明显升高(t=3.29、2.33, P<0.05或P<0.01);bFGF mRNA培养12 h表达量明显升高(t=12.59, P<0.01), 培养48 h明显降低(t=9.34, P<0.01);培养3、12、24 h PPAR-γ mRNA明显降低(t=5.14、6.56、4.97, P<0.05)。(3)与常氧组相比, 低氧组细胞培养3、6、12、24、48 h VEGF含量明显升高(t=5.74、12.37、14.80、15.70、34.63, P<0.05或P<0.01), 培养6、12、24、48 h IGF含量明显升高(t=5.65、8.06、20.12、22.99, P<0.05或P<0.01), 培养各时间点TGF-β和EGF含量无明显变化。(4)伤后0～11 d, 3组大鼠创面均不同程度缩小, 未见明显感染、渗出等。伤后11 d, PBS组大鼠创面面积仍较大;normo-CM组大鼠创面面积较PBS组缩小, hypo-CM组大鼠创面已基本愈合。伤后7 d, normo-CM组和hypo-CM组大鼠创面未愈合率明显低于PBS组(t=10.26、16.03, P<0.05)。伤后9 d, hypo-CM组大鼠创面未愈合率明显低于PBS组和normo-CM组(t=17.25、6.89, P<0.05或P<0.01), normo-CM组大鼠创面未愈合率明显低于PBS组(t=8.81, P<0.05)。伤后11 d, hypo-CM组大鼠创面未愈合率为(2.4±1.5)%, 明显低于PBS组的(20.0±5.0)%和normo-CM组的(7.7±1.7)%, t=30.15、84.80, P<0.05。(5)伤后3 d, hypo-CM组大鼠创面炎症细胞浸润明显多于其余2组;伤后9 d, normo-CM组和hypo-CM组大鼠创面炎症细胞浸润均少于PBS组;伤后11 d, hypo-CM组大鼠创面炎症细胞浸润明显少于PBS组和normo-CM组。(6)伤后9 d, hypo-CM组大鼠创面"表皮迁移舌"长度长于其他2组, 表皮厚度接近正常皮肤。伤后11 d, 与PBS组和normo-CM组相比, hypo-CM组大鼠创面中可见大量结构致密、排列整齐、成熟度较高的胶原沉积。PBS组大鼠创面CVF为(22.90±1.25)%, 显著低于normo-CM组的(31.96±0.14)%和hypo-CM组的(56.10±1.50)%(t=12.48、29.43, P<0.05);normo-CM组大鼠创面CVF显著低于hypo-CM组(t=27.73, P<0.05)。结论低氧处理可显著增强大鼠ADSC的旁分泌作用, 低氧预处理的大鼠ADSC条件培养基可通过调控炎症细胞浸润程度、促进创面再上皮化和胶原沉积, 加速大鼠全层皮肤缺损创面愈合。
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