gsdmd基因敲除巨噬细胞RAW 264.7的构建:基于CRISPR/Cas9系统

作者：周丽婷; 叶颖; 原海波; 吴超逸; 吴淑燕^*

来源：南方医科大学学报, 2021, 41(01): 116-122.

• CRISPR/Cas9
• 巨噬细胞
• gasdermin D

目的利用CRISPR/Cas9系统构建gsdmd基因敲除的巨噬细胞RAW 264.7,为研究gasdermin D(GSDMD)在巨噬细胞中的生物学功能提供细胞模型。方法针对gsdmd基因靶向设计4条向导RNA(sgRNA),构建pGL3-sgRNA串联载体后PCR、测序鉴定,将Cas9质粒和p GL3-sgRNA串联载体分两步电转至巨噬细胞RAW 264.7;qPCR检测cas9的表达;嘌呤霉素筛选出阳性单克隆后PCR、Western blot和测序鉴定。将鼠伤寒沙门菌与gsdmd-/-RAW 264.7细胞共培养,AnnexinⅤ/PI染色及比色法检测乳酸脱氢酶(LDH)释放水平分析细胞死亡情况。结果 q PCR结果表明获得稳定表达cas9的RAW 264.7-Cas9细胞(P<0.01);PCR及测序证明p GL3-sgRNA串联载体构建成功;PCR、测序及Western blot结果表明成功构建gsdmd-/-RAW 264.7细胞。AnnexinⅤ/PI染色及LDH释放水平发现敲除gsdmd可降低巨噬细胞死亡率(P<0.01)。结论本研究利用CRISPR/Cas9系统成功构建gsdmd-/-RAW 264.7细胞,为后续深入研究GSDMD介导的巨噬细胞死亡及其机制奠定基础。

• 单位
  苏州大学