登革病毒NS2B-NS3蛋白酶在大肠埃希菌中表达条件的优化及酶活性测定

作者：刘晓丽; 闫干干; 闫浩浩; 刘志成; 刘晓平^*; 陈云雨^*

来源：中国生物制品学杂志, 2023, 36(11): 1306-1312.

DOI：10.13200/j.cnki.cjb.003855

• 登革病毒
• NS2B-NS3蛋白酶
• 原核表达
• 亲和层析
• 荧光共振能量转移

目的 在大肠埃希菌(E.coli)中表达登革病毒(dengue virus,DENV)NS2B-NS3蛋白酶，对表达条件进行优化，并测定酶活性，为抗DENV药物先导化合物的筛选与发现奠定基础。方法 将密码子优化的NS2B-NS3基因连接到pET-28a载体中，构建重组原核表达质粒pET-28a-NS2B-NS3，转化至E.coli Rosetta(DE3)感受态细胞中，IPTG诱导NS2BNS3蛋白酶表达。通过优化诱导时间、诱导温度和IPTG诱导浓度，确定NS2B-NS3蛋白酶在E.coli中的最佳表达条件。使用HisTrapTM亲和层析柱分离纯化NS2B-NS3蛋白酶，通过荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer,FRET)试验测定酶活性。结果 重组原核表达质粒pET-28a-NS2B-NS3经双酶切(NheⅠ/XhoⅠ)及测序证明构建正确。NS2B-NS3蛋白酶在E.coli中的最佳表达条件为：诱导温度20℃，诱导时间10 h,IPTG浓度0.2 mmol/L，表达量达20 mg/L。纯化的NS2B-NS3蛋白酶纯度大于90%，可与小鼠抗His-tag单克隆抗体特异性结合，且具有良好的水解活性，其比活力为16 111 U/mg、米氏常数(Km)值为16.46μmol/L、催化常数(kcat)值为0.028/s。结论 成功制备了高纯度、高活性的DENV NS2B-NS3蛋白酶，为NS2B-NS3蛋白酶抑制剂高通量筛选模型的建立奠定了实验基础。

• 单位
  皖南医学院