PTD4-Cu,Zn-SOD原核重组表达载体优化及蛋白表达

作者：程艳; 万婷婷; 薛荣亮^*

来源：中国医药生物技术, 2021, 16(03): 215-221.

DOI：10.3969/j.issn.1673-713X.2021.03.004

• 蛋白质结构域
• 超氧化物歧化酶
• 质粒

目的优化PTD4-Cu,Zn-SOD原核重组表达载体以增加SOD融合蛋白表达。方法通过基因工程设计引物并优化PTD4-Cu,Zn-SOD原核重组表达载体,扩增并鉴定目的基因,将优化后的原核重组表达载体以热激法转化至E.coliBL21(DE3)中,通过IPTG诱导重组载体进行蛋白表达,通过溶菌酶+超声裂解菌体,离心后收集上清,利用Ni-NTA树脂纯化,10 kD,20k D透析袋浓缩,以获得SOD融合蛋白。利用SDS-PAGE凝胶电泳及Westernblot鉴定SOD融合蛋白。采用BCA与黄嘌呤氧化酶法测定SOD融合蛋白浓度及活力。结果优化后的重组表达载体优化了稀有碱基,增加了His·Tag标签,His·Tag-PTD4-Cu,Zn-SOD序列作为一个整体,在Nco I与Bam H I限制性内切酶作用下定向插入,构建了长度为6213bp的优化质粒,基因测序结果与预先设计的序列对比显示碱基序列正确。优化后的SOD融合蛋白表达量约占菌体的32%,较前(20%)提高,纯化浓缩后纯度为94%,较前(90%)增加。测定浓度为1.8 mg/ml,37℃时SOD总活力为(3065.137±19.75)U/mg prot。结论通过重组表达载体密码子优化,可以获得高产量、高活性的SOD融合蛋白。

• 单位
  陕西省人民医院; 北京大学第三医院