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摘要
目的 构建并鉴定靶向自然杀伤细胞2组成员D配体（NKG2DL）的嵌合抗原受体NK92（CAR-NK92）细胞[分泌白细胞介素15受体a与白细胞介素15的复合物（IL-15Ra-IL-15）],并验证NKG2D CAR-NK92细胞对多发性骨髓瘤细胞的杀伤活性。方法 通过筛选NKG2D的胞外段连接4-1BB、 CD3ζ、 IL-15Ra-IL-15序列构建CAR载体，包装慢病毒并转导NK92细胞，获得NKG2D CAR-NK92细胞；CCK-8法检测NKG2D CAR-NK92细胞的增殖能力，ELISA检测其IL-15Ra的分泌，乳酸脱氢酶（LDH）法检测其杀伤效率；流式细胞术检测细胞活化性受体NK细胞受体p30（NKp30）、 NKp44、 NKp46的表达，凋亡细胞群的比例以及CD107α表达、胞内颗粒酶B（granzyme B）和穿孔素（perforin）的释放，以进一步验证NKG2D CAR-NK92细胞对肿瘤的细胞毒性作用机制；通过NKG2D抗体抑制效应细胞、组胺抑制肿瘤细胞后，LDH法检测对细胞杀伤效率的影响；构建NCG(NOD-Prkdcem26Cd52Il2rgem26Cd22/Nju)小鼠多发性骨髓瘤异体移植模型，验证其体内抗肿瘤活性。结果 慢病毒转导后，NK92细胞的NKG2D表达显著增加；与NK92细胞相比，NKG2D CAR-NK92细胞的增殖能力稍弱，早期凋亡细胞群少于其亲本NK92细胞；NKG2D CAR-NK92对多发性骨髓瘤细胞的细胞毒性更强，在其培养上清液中可检测到IL-15Ra的分泌；NKp44蛋白在NKG2D CAR-NK92细胞上的表达量显著增加，活化效应增强；抑制试验显示，CAR-NK92细胞对MHC-Ⅰ类链相关蛋白A（MICA）和MICB阳性的肿瘤细胞的细胞毒性作用更依赖于NKG2D CAR和NKG2DL的相互作用；NKG2D CAR-NK92细胞经肿瘤细胞刺激后，granzyme B和perforin表达增加，且NK细胞显著上调CD107α的表达；在高度免疫缺陷NCG小鼠多发性骨髓瘤异体移植模型中，经NKG2D CAR-NK92细胞治疗的小鼠肿瘤明显缩小，且体质量无明显下降。结论 成功构建一种靶向NKG2DL的CAR-NK92细胞（分泌IL-15Ra-IL-15）,其对多发性骨髓细胞的杀伤作用明显。
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