基于T7核酸外切酶的一步法克隆初探

作者：金秋; 赵曼曼; 韦晔; 崔利兰; 张清仪; 孙磊; 卢大儒; 朱化星

来源：国际遗传学杂志, 2017, 40(05): 273-277.

• 分子克隆
• T7核酸外切酶
• 同源重组

目的检测T7核酸外切酶是否可用于同源重组介导的.DNA片段重组克隆技术。方法利用PCR方法克隆pUC19片段和卡那霉素供体片段后与T7核酸外切酶混合反应,将反应物直接转化大肠杆菌并克隆计数。结果末端互补的线性化双链DNA分子与T7核酸外切酶反应后,无需纯化,即可直接用于转化大肠杆菌。和其他不依赖于连接酶的克隆法相似,T7核酸外切酶的一步克隆法（T7 exonuclease dependent one-step cloning,EDOC）的效率与末端互补序列的长度成正比,互补序列大于等于10 bp时即可稳定地产生克隆,互补区内的突变不利于同源重组发生。测序结果显示EDOC是一种精确克隆法,并未发现缺失,插入和点突变生成。结论证实了T7核酸外切酶可被用于重组DNA的精确拼接,并成功建立了依赖于EDOC。

• 单位
  生命科学学院; 复旦大学; 遗传工程国家重点实验室; 吴江近岸蛋白质科技有限公司; 上海近岸生物科技有限公司