毕赤酵母GT1的原核表达与体外功能鉴定

作者：潘颖越; 董贵彬; 王荣斌; 刘国强; 刘春立; 刘秀霞; 白仲虎; 杨艳坤^*

来源：生物学杂志, 2021, 38(03): 47-51.

• 巴斯德毕赤酵母
• 甘油转运体
• 膜蛋白表达
• MFS蛋白超家族
• 蛋白-分子相互作用

为了开展体外互作实验,以pXMJ19质粒为载体构建pXMJ19-gt1-His重组质粒,通过单因素优化实验获得毕赤酵母甘油转运体GT1的最优表达宿主为C41(DE3);最优表达条件为OD600达到0.7时加入终浓度为0.1 mmol/L的异丙基β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG),于30℃、110 r/min诱导10 h。通过超速离心验证了部分GT1蛋白在大肠杆菌中位于细胞质膜上,并筛选得到针对GT1重溶解率最高的去垢剂NP-40。在去垢剂环境下通过镍离子亲和层析纯化得到GT1蛋白,然后利用等温滴定量热法体外检测其与甘油的结合能力,结果表明:GT1与甘油在体外相互作用产生放热反应,且测得其与甘油的平衡解离常数KD值为6.58μmol/L。实验说明原核表达的GT1蛋白具有活性,且与甘油的体外相互作用明显,为GT1以甘油为配体进行结晶以及解析其三维结构提供了研究基础。

• 单位
  生物工程学院; 工业生物技术教育部重点实验室; 江南大学