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摘要
【目的】观察经补肾益精法处理后人脐静脉内皮细胞（HUVEC）来源的外泌体对系统性硬皮病血管损伤的治疗作用。【方法】（1）体外研究：制备大鼠补肾益精中药复方含药血清，通过血管内皮细胞成管实验观察含药血清与对照血清对HUVEC成管的影响，细胞免疫荧光染色法检测血小板内皮细胞黏附分子1（CD31）表达。采用超速离心法提取HUVEC细胞上清液中外泌体，透射电镜观察外泌体形态，Nano Analyzer法检测外泌体径粒与浓度，Western Blot法检测外泌体标志物的表达。设置对照血清干预HUVEC来源的外泌体组（对照血清-外泌体组）和含药血清干预HUVEC来源的外泌体组（含药血清-外泌体组），用外泌体处理HUVEC后，通过成管实验观察HUVEC成管能力，细胞免疫荧光染色法检测CD31表达。（2）体内研究：设置正常组、模型组及外泌体组。采用皮下注射博来霉素(100μL·mg-1·d-1)28 d构建硬皮病小鼠模型。此外，模型组及外泌体组小鼠在造模第1、7天分别额外给予外泌体悬液及含药血清-外泌体局部皮下注射。4周后，观察小鼠皮肤组织病理变化，免疫组织化学法检测小鼠皮肤组织血管生成素1（ANG-1）、血管内皮细胞生长因子（VEGF）、血管性假血友病因子（vWF）、CD31表达水平。【结果】与对照组比较，含药血清组与含药血清-外泌体组的HUVEC成管能力及CD31表达均显著增强。电镜下可见类圆形高亮膜性微囊泡，外泌体的标志物表达增强。HE染色结果显示，与模型组比较，外泌体组小鼠皮肤胶原纤维含量有所减少，胶原间隙增宽，血管数量增多；免疫组织化学结果显示外泌体组小鼠皮肤ANG-1、VEGF、v WF、CD31表达水平显著高于模型组，较正常组有所降低。【结论】补肾益精法可通过HUVEC来源的外泌体途径发挥对系统性硬皮病的血管保护作用。
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