通过全长cDNA扩增及高通量测序技术获取呼肠孤病毒科病毒的全基因组序列

作者：李占鸿; 宋子昂; 朱建波; 杨振兴; 李卓然; 李华春; 杨恒^*

来源：农业生物技术学报, 2021, 29(01): 93-104.

DOI：10.3969/j.issn.1674-7968.2021.01.010

• 呼肠病毒科病毒
• 全长cDNA扩增(FLAC)
• 二代测序(NGS)
• 全基因组测序

获取呼肠孤病毒科(Reoviridae)病毒的全基因组序列在该科病毒的分类学和流行病学研究及诊断试剂开发等方面具有重要意义。本研究通过全长cDAN扩增(full-length amplification of cDNAs,FLAC)与二代测序(next generation sequencing, NGS)技术,获取了蓝舌病病毒(Bluetongue virus, BTV)、流行性出血病病毒(Epizootic haemorrhagic disease virus, EHDV)、帕利亚姆病毒(Palyam virus, PALV)、广西环状病毒(Guangxi orbivirus, GXOV)、西藏环状病毒(Tibet orbivirus, TIBOV)、哺乳动物正呼肠孤病毒(Mammalian orthoreovirus, MRV)、版纳病毒(Banna virus, BAV)和芒市病毒(Mangshi virus, MSV)等8种不同呼肠孤病毒科病毒的全基因组序列。本研究建立的FLAC技术,具有高度的灵敏性,无需目标病毒的任何基因序列信息与引物设计,可在1个反转录PCR (reverse transcription-PCR, RT-PCR)反应中扩增不同种属呼肠孤病毒科病毒完整的基因组DNA。扩增8种病毒的基因组大小在18 266至23 605 bp之间,基因节段数目为10或12节段。将扩增病毒的全基因组PCR产物进行NGS测序与从头组装(de novo)拼接,可在1周内获取病毒的全基因组序列。不同毒株测序产生的数据量在1.6～1.9 Gb之间,用于病毒基因组拼接的reads数(Q>30)在293 016 800至423 210 600之间,病毒基因组中每个碱基位点的测序深度在6 000至20 000之间。呼肠孤病毒科病毒全基因组扩增与高通量测序技术的建立,为快速准确地获取呼肠孤病毒科病毒的全基因组序列,开展病毒进化与变异、诊断试剂开发与流行病学等方面的研究提供了技术保障。

• 单位
  云南省畜牧兽医科学院; 云南农业大学