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摘要
目的:定点突变合成p53基因突变子,构建绿色荧光蛋白表达载体,进而观察其在HepG2细胞中与内源性热休克蛋白70的共定位关系。方法:以野生型p53为模板,采用PCR体外定点突变技术通过重叠延伸法2次PCR扩增得到目的基因片段,进一步将其克隆到绿色荧光蛋白载体pEGFP-C3中。将构建好的载体转染到HepG2细胞中,利用免疫荧光染色法检测内源性热休克蛋白70的表达,利用荧光显微镜观察hsp70与p53的共定位关系。结果:测序结果显示片段插入正确,在预期位点发生了点突变,249位氨基酸由AGG突变为AGC,273位氨基酸由CGT突变为CAT。载体成功构建。转染后观察到热休克蛋白70与273Hp53共同定位于肝癌细胞系HepG2的胞质,而wtp53与249M p53均定位于细胞核。结论:热休克蛋白70与不同点突变的p53在肝癌细胞系HepG2中的共定位关系与之前我们在肝癌组织中发现的hsp70与p53共定位关系不同,这些提示在hsp70与p53的共定位关系和相互作用上存在某种尚未阐明的机制。
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单位西京医院; 第四军医大学
