RNA干扰沉默雷帕霉素靶蛋白基因表达对血管平滑肌细胞增殖活性的影响

作者：胡新华; 张强; 杨军; 杨德华; 刘程伟; 张志深

来源：中华实验外科杂志, 2006, (10): 1181-1183.

DOI：10.3760/j.issn:1001-9030.2006.10.011

• 雷帕霉素
• RNA干扰
• 血管
• 平滑肌细胞

目的构建靶向雷帕霉素靶蛋白(mTOR)的RNA干扰表达载体,观察其对血管平滑肌细胞(VSMC)增殖活性的影响。方法根据大鼠mTOR基因序列设计2个短发夹环RNA (shRNA)序列,化学法合成单链寡核苷酸序列,将cDNA序列插入逆转录病毒载体pLXIN,脂质体介导转染包装细胞PT67后获得mTOR的重组逆转录病毒shRNA表达载体,感染VSMC,Northern blot和Western blot法检测mTOR及其下游底物真核细胞启动子4E结合蛋白(4E-BP1)、p70s6k等表达的变化,流式细胞仪检测VSMC细胞周期的变化,噻唑蓝(MTT)法检测VSMC增殖活性的改变。结果shRNA序列插入pLXIN载体并感染VSMC,证实其能够显著抑制mTOR的mRNA和蛋白产物表达,mTOR通路下游的核糖体蛋白S6激酶(p70s6k)表达相应减少,而4E-BP1的表达却显著增强；感染前VSMC细胞G_1/G_0,期比例为71%,S期为15%,凋亡细胞为2%；转染后72 h,G_1/ G_0期比例为87%,S期为6%,凋亡细胞为6%(P＜0．01)；表明G_0/G_1μ→S过程受阻,VSMC的分裂、增殖受到抑制,凋亡机制启动,更多细胞停滞在G_0/G_1期。结论成功构建靶向mTOR基因的shRNA表达载体,能够明显抑制VSMC分裂、分化和增殖。

• 单位
  中国医科大学附属第一医院