猪流行性腹泻病毒截短M基因克隆、生物信息学分析及其截短片段表达

作者：张明亮; 耿亚春; 连凯琪^*; 马磊; 常莹; 王双山; 张福良

来源：中国畜牧兽医, 2022, 49(04): 1479-1487.

DOI：10.16431/j.cnki.1671-7236.2022.04.030

• 猪流行性腹泻病毒(PEDV)
• M基因
• 生物信息学分析
• 原核表达

【目的】探索猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)截短M蛋白的序列结构特征与原核表达情况。【方法】根据已公布的PEDV M基因序列设计1对特异性引物，以从阳性病料提取的RNA为模板，通过RT-PCR扩增并克隆PEDV截短的M基因(rM),应用在线生物信息学软件预测rM蛋白的结构特征。将得到的截短的M基因克隆至原核表达载体pET-28a(+)中，构建原核表达质粒pET-28a-rM,将鉴定正确的pET-28a-rM转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，成功构建重组菌株BL21(pET-28a-rM),并对重组菌株进行IPTG诱导表达，优化重组蛋白的表达条件，重组蛋白经亲和层析纯化后进行SDS-PAGE及Western blotting检测，同时应用重组蛋白制备兔抗rM多克隆抗体。【结果】试验克隆得到大小为366 bp的截短的M基因，重组蛋白由121个氨基酸组成，预测蛋白分子质量大小约为12.8 ku。该蛋白的二级结构由无规则卷曲、延伸链、β-转角和α-螺旋组成，占比分别为48.76%、33.88%、9.09%和8.26%。该蛋白不含信号肽，但有跨膜区，包含21个磷酸化位点。SDS-PAGE结果显示，重组蛋白大小约为15 ku,以包涵体蛋白形式存在，在37℃、1 mmol/L IPTG诱导12 h时蛋白的表达量最高。Western blotting检测结果表明，重组蛋白与PEDV阳性血清具有较好的反应原性，纯化的重组蛋白免疫新西兰大白兔获得的高免血清效价高于1∶51 200。【结论】本研究成功克隆PEDV截短的M基因，对rM蛋白进行了生物信息学分析，获得了高纯度的rM蛋白，为猪流行性腹泻治疗及检测用生物制品的开发奠定了基础。

• 单位
  安阳工学院