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摘要
本文研究了野生和突变H7N9禽流感病毒神经氨酸酶(Neuraminidase,NA)对奥司他韦羧酸盐及扎那米韦的敏感性。将密码子优化的H7N9(A/Hangzhou/1/2013)病毒神经氨酸酶DNA克隆到pcDNA3.1/His载体(简称NAH7N9-WT质粒)后,将该质粒转染293T细胞,48h后裂解收集上清液,得到野生型H7N9神经氨酸酶。利用一步PCR突变法,在NAH7N9-WT质粒中引入H274Y和R292K突变(NA以N2编号),简称NAH7N9-H274Y、NAH7N9-R292K质粒,测序确认正确后将两种突变质粒转染293T细胞,48h后裂解收集上清液,获得突变H7N9神经氨酸酶。Western blot鉴定野生和突变NA的表达。以4-MUNANA为底物检测野生及突变NA活性,检测奥司他韦羧酸盐和扎那米韦对野生及突变NA的抑制活性。结果显示,野生及突变NA质粒转染细胞后均获得了分子量约为70kD的目标蛋白,但H274Y突变酶的表达量显著低于野生酶及R292K突变酶;所表达的NAH7N9-WT、NAH7N9-H274Y和NAH7N9-R292K均有活性;奥司他韦羧酸盐对NAH7N9-WT、NAH7N9-H274Y和NAH7N9-R292K的半数抑制浓度分别为1.6nM、15.1nM和大于1 000nM,耐药倍数分别为9和大于625倍;扎那米韦对NAH7N9-WT、NAH7N9-H274Y和NAH7N9-R292K的半数抑制浓度分别为1.1nM、1.4nM和38.0nM,耐药倍数分别为1.3和34倍。本研究结果表明奥司他韦和扎那米韦可显著抑制NAH7N9-WT活性,NAH7N9-R292K对奥司他韦和扎那米韦有显著的耐药性(耐药倍数34625倍),NAH7N9-H274Y对奥司他韦和扎那米韦敏感(耐药倍数19倍)。结果提示,临床感染H7N9的患者可用扎那米韦或奥司他韦治疗,但当该病毒发生NAH7N9-R292K突变时,建议停止使用这两种药物。
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单位北京协和医学院; 天津市肿瘤医院; 中国医学科学院药物研究所
