单分子成像显示视网膜血管内皮细胞膜上血管内皮生长因子受体2聚集状态

作者：杨宋阳; 张明亮; 胡岚岚; 王礼明; 张晓敏; 李筱荣^*

来源：中华眼底病杂志, 2021, 37(02).

• 血管内皮生长因子受体2
• 视网膜血管
• 内皮细胞
• 单分子成像

目的观察单个视网膜血管内皮细胞膜上血管内皮生长因子受体2 (VEGFR2)的聚集状态。方法将猴视网膜血管内皮细胞(RF/6A)分为空白对照组(正常培养)、质粒转染组[转染VEGFR2-绿色荧光蛋白(GFP)重组质粒]。采用共聚焦显微镜观察质粒转染组GFP的表达;实时荧光定量聚合酶链反应(qPCR)、蛋白免疫印迹法(Western blot)检测细胞中VEGFR2的mRNA和蛋白表达情况;单分子成像技术记录细胞膜上表达的单个VEGFR2-GFP分子的荧光强度分布和漂白步数, 判断受体的寡聚或多聚状态。结果共聚焦显微镜观察发现, 转染12 h后, 质粒转染组细胞可见GFP绿色荧光。qPCR检测结果显示, 质粒转染组细胞中VEGFR2、GFP mRNA表达较空白对照组显著升高, 差异均有统计学意义(t=11.240、12.330, P<0.001、0.001)。Western blot检测结果显示, 质粒转染组细胞VEGFR2蛋白表达较空白对照组增强, 差异有统计学意义(t=8.346, P<0.01 )。单分子成像结果显示, 无配体刺激时RF/6A细胞膜表面上VEGFR2- GFP的荧光强度分布为双峰, 其中单体、二聚体比例分别为86.0%、14.0%;通过计数GFP荧光漂白步数, 静息状态下受体单体、二聚体、三聚体和四聚体比例分别为81.4%、12.9%、5.5%、0.3%。结论无配体状态下, VEGFR2在RF/6A细胞膜表面以单体和包括二聚体在内的多聚体形式共存, 以单体为主。

• 单位
  天津医科大学; 天津医科大学眼科医院