猪病毒性腹泻病相关病原的MLPA检测技术的建立及应用

作者：何海健; 刘正奎; 吴瑗; 王志鹏; 陈琳; 王磊; 周莹珊; 蒋春燕; 宋厚辉^*; 王晓杜^*

来源：农业生物技术学报, 2020, 28(09): 1699-1710.

• 猪病毒性腹泻
• 多重连接探针扩增技术(MLPA)
• 毛细管电泳
• 灵敏度

每年冬春季爆发于规模化养猪场的腹泻常由不同病毒引起,临床表现为相似腹泻症状。为了区分临床腹泻样本中的病毒性病原体,迫切需求建立一种快速同时检测常见6种病毒性腹泻疾病的病原技术。本研究针对猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)S基因、猪传染性胃肠炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus, TGEV)N基因、猪Delta冠状病毒(Porcine delta coronavirus, PDCoV)N基因、猪博卡病毒(Porcine bocavirus, pBCaV)NS1基因、猪诺如病毒(Porcine norovirus, pNoV)RdRp基因、猪轮状病毒(Porcine rotavirus, pRV)NSP1基因的核酸保守区域,设计多重连接探针扩增技术(multiplex ligationdependent probe amplification, MLPA)探针和预扩增引物,利用MLPA技术和毛细管电泳技术,建立检测6种疾病病原核酸的检测方法。结果表明,单一探针检测混合模板,显示出高度特异性;混合探针总浓度在1.33 nmol/L时,各种疾病扩增条带具有特异性且与预期大小一致,pBCaV、p NoV、PDCoV、PEDV、pRV、TGEV分别约为102、110、117、124、131、138 bp。本方法与其他临床疾病如猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV)、猪瘟病毒(Classic swine fever virus, CSFV)、伪狂犬病毒(Pseudorabies virus, PRV)和猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2, PCV2)没有交叉反应,特异性佳。pBCaV、pNoV、PDCoV、PEDV、p RV、TGEV检测最低极限值分别为:7.58×101、7.56×100、7.54×100、7.53×100、7.50×101和7.49×100copies/μL。组间和组内重复性好,利用本方法检测临床收集和模拟样本67份,PEDV与病毒分离方法 100%符合,p RV、TGEV、pBCaV、pNoV、PDCoV与病毒模拟样本符合率达到100%。本研究为临床提供一种新型的可同时检测6种腹泻病原的技术,为临床疾病防控快速反应提供技术支持。

• 单位
  金华职业技术学院; 浙江农林大学; 动物科技学院; 生物工程学院