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摘要
目的利用显色法芯片技术建立快速鉴定分枝杆菌菌种的方法。方法根据美国国家生物技术信息中心(NCBI)提供的分枝杆菌16SrDNA基因的保守区和突变区(第129~267位核苷酸的A突变区、第430~500位核苷酸的B突变区)分别设计引物和寡核苷酸探针,用地高辛标记引物并制备玻璃芯片。采用双重PCR技术分别对16种分枝杆菌标准株、5种非分枝杆菌标准株和120株分枝杆菌临床分离株(非结核分枝杆菌40株、结核分枝杆菌复合群80株)进行扩增,扩增产物分别与玻璃芯片进行杂交检测,尼龙膜显色,以显现蓝黑色斑点作为阳性信号,并根据其在芯片方阵中的位置判断分枝杆菌种类。根据芯片杂交结果,选取部分经显色法芯片技术检测的临床分离株进行DNA测序。结果16种分枝杆菌标准株和120株分枝杆菌临床分离株经PCR扩增均各产生2条DNA片段,其中1条长度为272~280bp,1条长度为183~192bp。16种分枝杆菌标准株均与芯片上特异性探针杂交,应用显色法芯片技术分析16种分枝杆菌标准株和5种非分枝杆菌标准株的特异性为100%。120株分枝杆菌临床分离株均与分枝杆菌属探针a杂交,其中79株确定为结核分枝杆菌复合群,38株确定为非结核分枝杆菌(不产色分枝杆菌17株,胞内分枝杆菌8株,猿猴分支杆菌6株,瘰疬分枝杆菌5株,偶然分支杆菌2株),另3株只与分枝杆菌属探针a杂交,没有鉴定到种。选取的26株分枝杆菌临床分离株(结核分枝杆菌复合群8株,不产色分枝杆菌5株,胞内分枝杆菌、猿猴分枝杆菌、未鉴定到种的分枝杆菌各3株,瘰疬分枝杆菌、偶然分枝杆菌各2株)DNA测序显示,未鉴定到种的3株分枝杆菌中,1株为结核分枝杆菌突变株,1株为Mycobacteriumlentiflavum,1株为Mycobacteriumarupense,芯片上无后2种菌株的特异性探针;其余23株菌株测序结果与芯片检测结果一致。结论显色法芯片技术能简便、快速、灵敏、特异地将大多数分枝杆菌鉴定到种,具有一定的临床推广应用价值。
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