科研之友
微信
新浪微博
Facebook
分享链接
摘要
目的探讨环指蛋白43(RNF43)对黑色素瘤中CD8+ T细胞介导的抗肿瘤免疫反应的调节作用。方法利用慢病毒感染技术对小鼠黑色素瘤细胞株B16-OVA进行RNF43基因过表达与敲低;通过小鼠皮下成瘤实验检测Lv-Ctrl-OE组、Lv-RNF43-OE组、Lv-Ctrl-KD组和Lv-RNF43-KD组小鼠黑色素瘤细胞株B16-OVA体内增殖情况, 通过流式细胞术检测黑色素瘤肿瘤免疫微环境中CD8+ T细胞穿孔素和γ干扰素(IFN-γ)的表达水平;采用实时荧光定量PCR实验检测细胞中β-catenin和程序性死亡受体配体1(PD-L1) mRNA的表达水平;通过双荧光素酶报告基因实验检测RNF43对PD-L1的转录调控作用。结果本研究成功构建RNF43稳定过表达与敲低的小鼠黑色素瘤细胞株Lv-RNF43-OE和Lv-RNF43-KD。小鼠皮下成瘤实验结果显示, Lv-RNF43-OE组瘤体质量为(0.08±0.06)g, 明显小于Lv-Ctrl-OE组的(1.04±0.52)g, 差异有统计学意义(t=3.71, P=0.032);Lv-RNF43-KD组瘤体质量为(1.94±0.29)g, 与Lv-Ctrl-KD组的(1.15±0.74)g相比差异无统计学意义(t=-1.70, P=0.164)。流式细胞术结果显示, Lv-RNF43-OE组CD8+ T细胞穿孔素荧光强度为9 034±2 628, 明显高于Lv-Ctrl-OE组的3 847 ±1 637, 差异有统计学意义(t=-3.35, P=0.015);Lv-RNF43-KD组CD8+ T细胞穿孔素荧光强度为966±247, 明显低于Lv-Ctrl-KD组的2 226±646, 差异有统计学意义(t=3.16, P=0.034);Lv-RNF43-OE组CD8+ T细胞IFN-γ荧光强度为2 422±429, 明显高于Lv-Ctrl-OE组的1 688±324, 差异有统计学意义(t=-2.73, P=0.034);Lv-RNF43-KD组CD8+T细胞IFN-γ荧光强度为614(454, 863), 与Lv-Ctrl-KD组的1 159(1 152, 2 068)相比差异有统计学意义(Z=-1.96, P=0.050)。实时荧光定量PCR实验结果显示, Lv-RNF43-OE组β-catenin mRNA相对表达量为0.67±0.16, 明显低于Lv-Ctrl-OE组的1.00±0.11, 差异有统计学意义(t=2.98, P=0.041);Lv-RNF43-OE组PD-L1 mRNA相对表达量为0.32±0.09, 明显低于Lv-Ctrl-OE组的1.00±0.09, 差异有统计学意义(t=9.13, P=0.001)。双荧光素酶报告基因实验结果显示, pCMV6-NC组、RNF43组、RNF43+β-catenin组和β-catenin组PD-L1启动子荧光素酶活性分别为1.00±0.00、0.84±0.00、1.49±0.00和1.57±0.03(F=2 218.33, P<0.001), 进一步两两比较发现, 与pCMV6-NC组相比, RNF43组PD-L1启动子荧光素酶活性明显降低(P<0.001), RNF43+β-catenin组和β-catenin组PD-L1启动子荧光素酶活性明显升高(P<0.001;P=0.003);与RNF43组相比, RNF43+β-catenin组PD-L1启动子荧光素酶活性明显升高(P<0.001)。结论 RNF43可能通过抑制β-catenin的表达降低黑色素瘤中PD-L1 mRNA的表达并促进CD8+ T细胞介导的抗肿瘤免疫反应。
- 单位
