本发明公开了一种ACAT1基因干扰的嵌合抗原受体T细胞的构建和应用。具体地,本发明提供了一种抑制ACAT1基因表达的干扰RNA,以及包含所述干扰RNA和嵌合抗原受体编码序列的核酸构建物,并基于所述shRNA和核酸构建物制备了增强型的CAR-T细胞。本发明的干扰RNA可以有效抑制ACAT1基因的表达,显著增强CAR-T细胞对肿瘤细胞的杀伤效率。