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摘要
真核表达系统因具有完整的翻译后修饰、表达蛋白免疫原性较小而成为制药行业生产蛋白药物的新方向。该研究目的是构建CD137L融合基因真核表达载体,瞬时转染HEK293F细胞实现高效表达并进行蛋白纯化与活性分析。以该实验室保存的含有CD137L融合基因的质粒p ET11a-FP为模板,采用PCR技术在目的基因N端添加长腹水蚤荧光素酶信号肽和Kozak基因序列、C端添加6×His纯化标签,使用XbaⅠ、EcoRⅠ限制性内切酶酶切并插入pc DNA3.1 (+)载体,并对其进行双酶切和测序鉴定,通过转染试剂PEI将构建成功的pc DNA3.1-FP真核表达质粒瞬时转染进入HEK293F细胞,对转染复合物比例及表达时间等参数进行优化。SDSPAGE电泳和Western印迹检测结果表明每毫升细胞转染1.5μg质粒和7.5μg转染试剂、表达4 d时融合蛋白表达水平最高。镍柱亲和纯化结果显示,每升培养基上清可以纯化获得1 mg目的蛋白,功能活性分析表明CD137L融合蛋白能够有效激活人PBMC细胞增殖和抑制人HUVEC细胞的生长。综上所述,该研究成功构建了CD137L融合基因的真核表达载体并在HEK293F细胞中实现了分泌表达,为该融合蛋白的进一步稳定表达、大规模放大和成药性研究奠定了基础。
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