牛脂肪间充质干细胞的分离培养及分化潜能的研究

作者：王亚芹; 宗俊霖; 张涛^*; 关伟军^*

来源：中国畜牧兽医, 2023, 50(09): 3530-3540.

DOI：10.16431/j.cnki.1671-7236.2023.09.009

• 脂肪间充质干细胞
• 分离培养
• 诱导分化
• 荷斯坦牛

【目的】对荷斯坦牛脂肪来源的间充质干细胞(adipose derived mesenchymal stem cells, AD-MSCs)进行体外分离与培养，研究其生物学特性，为干细胞临床研究提供一种新型可用的种子细胞。【方法】无菌收集2月龄荷斯坦牛胚胎的腹股沟脂肪组织，使用Ⅰ型胶原酶消化收集细胞进行培养，使用荧光抗体技术和RT-PCR检测细胞膜表面特异性标记物(CD29、CD44、CD73、CD166、CD34、CD45),利用纯化后的细胞绘制P4、P10、P16代生长曲线并计算群体倍增时间，利用细胞克隆形成试验计算克隆形成率，染色体核型分析判断细胞遗传是否稳定，通过向AD-MSCs培养皿中添加诱导液，验证其向成脂、成骨、成软骨的分化潜能。【结果】体外分离培养的细胞呈贴壁漩涡状生长，细胞形态为长梭形。荧光抗体技术和RT-PCR检测结果表明，CD29、CD44、CD73和CD166细胞膜表面抗原被表达，CD34和CD45不被表达，确定分离的细胞为AD-MSCs。绘制的细胞生长曲线为S型，P4、P10、P16代细胞群体倍增时间分别为33、35、44 h,克隆形成率分别为(51.67±1.53)%、(38.00±2.00)%、(25.00±1.00)%,2个指标在3个代次间差异均显著(P<0.01;P<0.05)。核型结果表明，AD-MSCs为正常二倍体(2n=60,XX),染色体形态均为端着丝粒，无畸变。诱导分化结果显示，在体外AD-MSCs具有成脂、成骨、成软骨的分化潜能，分别出现明显的脂滴、钙结节和软骨团，且分别表达成脂诱导基因脂蛋白脂肪酶(LPL)和过氧化物酶体增殖物激活受体(PPAR-γ)、成骨诱导基因Ⅰ型胶原蛋白(COLⅠ)和骨桥蛋白(OPN)、成软骨诱导基因SRY样HMG盒9(SOX-9)和软骨蛋白聚糖抗体(ACAN)。【结论】用荷斯坦牛胚胎能成功在体外分离原代AD-MSCs,细胞形态具有典型的间充质干细胞形态，具有成脂、成骨、成软骨细胞的分化潜能，且细胞具有增殖能力快、稳定等特点，可以为组织和器官修复提供种质资源。

• 单位
  基础医学院; 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所; 佳木斯大学