奶牛妊娠相关糖蛋白PAG6多克隆抗体的制备及鉴定

作者：李志明; 袁梦仪; 许海涛; 蔡德霖; 王相国; 肖龙菲; 安红; 王颖秋; 王骞; 郭勇; 齐晓龙; 倪和民^*

来源：农业生物技术学报, 2022, 30(08): 1632-1639.

• 奶牛
• 妊娠相关糖蛋白6 (PAG6)
• 原核表达
• 多克隆抗体

基于抗原抗体反应检测奶牛(Bos taurus)血液中妊娠相关糖蛋白(pregnancy-associated glycoproteins, PAGs)是目前世界上应用最普遍的牛早孕检测技术，以boPAG6作为标志物应用于母牛早期妊娠诊断的准确性更高，因此制备高敏感性的boPAG6多克隆抗体，能为奶牛早期妊娠诊断试剂盒的研发提供支持。本研究利用PCR技术扩增荷斯坦奶牛boPAG6 (GenBank No. NM＿176617.2)基因，构建重组质粒pET30a-boPAG6；在大肠杆菌(Escherichia coli) BL21(DE3)中表达His-boPAG6蛋白并优化，以重组蛋白His-boPAG6作为免疫原免疫BALB/c小鼠(Mus musculus)制备多克隆抗体，用ELISA方法检测血清效价，Western blot方法检测纯化后的抗体分别与重组蛋白His-boPAG6和奶牛血清的特异性反应，利用免疫荧光技术定位boPAG6在原代滋养层细胞中的表达。结果显示，本研究成功构建出大小为6 534 bp的重组质粒pET30a-boPAG6，并在异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside, IPTG)终浓度为0.5 mmol/L、诱导时间为8 h的条件下表达的His-boPAG6量最高，其蛋白分子质量为50 kD。以纯化后浓度为0.412 mg/mL的His-boPAG6蛋白免疫，ELISA中抗血清的效价为1∶102 400，多克隆抗体能特异性识别His-boPAG6抗原并有效区分妊娠和未妊娠奶牛血清，还可检测到原代滋养层细胞中存在boPAG6蛋白。本研究成功制备了boPAG6多克隆抗体，为奶牛早期妊娠ELISA检测系统的开发提供了理论支持。

• 单位
  北京农学院; 全国畜牧总站