通过hiPS细胞诱导生成类肝细胞建立肝毒性检测模型及其初步评价

作者：胡秋艳; 谭庆龙; 徐雯星; 刘春萍; 曾星

来源：中药新药与临床药理, 2018, 29(01): 91-96.

DOI：10.19378/j.issn.1003-9783.2018.01.019

• 人诱导多能干细胞
• 类肝细胞
• 细胞免疫荧光法
• 实时荧光定量聚合酶链式反应
• 吲哚青绿
• 雷公藤
• 肝毒性

目的探讨通过人诱导多能干细胞(human induced pluripotent stem cells,hiPS cells)诱导生成类肝细胞,建立肝毒性检测模型并用于中药毒性体外评价的可行性。方法采用细胞因子4步诱导分化方法,通过加入激活素A(Activin A)、骨形态发生蛋白-4(BMP-4)、成纤维细胞生长因子-2(FGF-2)、肝细胞生长因子(HGF)、制瘤素M(Oncostatin M)等细胞因子,连续培养23 d,将hiPS细胞诱导分化成类肝细胞。采用细胞免疫荧光法检测hiPS细胞向类肝细胞分化过程不同阶段的特异性标记:叉头框转录因子A2(FOXA2)、性别决定区Y框蛋白17(SOX17)、甲胎蛋白(AFP)、白蛋白(ALB)、肝细胞色素P4503A4酶(CYP3A4)和α1-抗胰蛋白酶(AAT)等蛋白的表达;采用q PCR法检测类肝细胞特异性基因:甲胎蛋白(AFP)、白蛋白(ALB)、细胞角蛋白8(CK8)、细胞角蛋白18(CK18)和细胞角蛋白19(CK19)的基因表达;采用吲哚青绿(ICG)摄取实验检测类肝细胞排泌功能。采用雷公藤冻干粉(1,2,4,8 mg·m L~(-1))对类肝细胞进行肝毒性实验,作用24 h后检测谷草转氨酶(AST)、谷丙转氨酶(ALT)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽(GSH)、超氧化物歧化酶(SOD)的含量或活性。结果检测到FOXA2、SOX17蛋白在内胚层诱导阶段有表达,AFP、ALB在肝细胞分化与扩增阶段有表达,CYP3A4、AAT在肝细胞成熟阶段有表达;肝细胞特异性基因AFP、CK19、ALB、CK8、CK18在类肝细胞中均有表达,诱导前后比较差异有统计学意义(P<0.05);ICG摄取实验显示类肝细胞具有肝细胞的特异性ICG摄取功能。与对照组比较,雷公藤各剂量组的ALT及AST活性显著升高、MDA浓度显著升高、GSH及SOD活性显著降低,差异均有统计学意义(P<0.05,P<0.01)。结论通过hiPS细胞诱导生成类肝细胞的方法具有可行性,诱导得到的类肝细胞具有人正常肝细胞的功能,可以作为中药肝毒性筛选的模型细胞。

• 单位
  广州中医药大学第二附属医院