汉坦病毒S片段荧光定量PCR参考标准品的构建

作者：周欣; 李燕婷; 沈荣明; 沈微娟; 瞿涤

来源：上海预防医学杂志, 2006, (09): 432-434.

DOI：10.19428/j.cnki.sjpm.2006.09.002

• S片段
• 实时荧光定量PCR
• 标准品

[目的]构建汉坦病毒S片段标准品,用于实时荧光定量PCR检测汉坦病毒。[方法]对S片段基因进行序列分析,利用引物设计软件设计出一对引物和一条荧光探针,提取病人总RNA,逆转录为cDNA,经PCR扩增,产物纯化后与PMD 18-T Vector连接,转化到大肠杆菌DH5α,筛选得到标准品的质粒,提取质粒并进行定量。[结果]重组S片段基因质粒进行荧光定量PCR扩增出现强烈的荧光值增长,表明基因已成功克隆。以不同稀释水平的标准品进行扩增,统计学分析显示C t值与标准品浓度的对数存在良好线性关系,回归系数在0.99以上。成功制备并获得稳定的S片段重组质粒。[结论]该方法能大量制备质粒标准品,如何进行荧光RT-PCR条件的优化是关键所在。

• 单位
  上海市疾病预防控制中心; 复旦大学