采用Gateway~(TM)技术构建人骨形态发生蛋白-2基因重组腺病毒载体

作者：蒋红梅; 龙洁; 汤炜; 田卫东; 刘磊; 林云锋; 王杭; 李鹏

来源：现代生物医学进展, 2008, (02): 209-212.

DOI：10.13241/j.cnki.pmb.2008.02.002

• 骨形态发生蛋白-2
• Gateway~(TM)技术
• 重组腺病毒

目的:采用基于attLXattR的λ噬菌体位点特异性重组系统的Gateway~(TM)技术构建人骨形态发生蛋白-2基因重组腺病毒载体(Ad-hBMP-2)。方法:从pcDNA3.1质粒中获取目的基因hBMP-2片段,连入带attL1、attL2位点的入门载体pENTRTM11中,形成入门克隆,将入门克隆与带attR1、attR2位点的目的载体Ad/CMV/V5-DEST在高效重组酶作用下发生体外重组形成表达克隆ad-BMP-2,经鉴定将ad-BMP-2线性化后转入293A细胞包装,通过细胞裂解法获得人骨形态发生蛋白-2的基因重组腺病毒珠Ad-hBMP-2,将其扩增,采用western blotting技术分析目的蛋白表达。结果:经酶切及测序证实目的基因BMP-2片段按正确方向重组入目的载体中,带BMP-2的目的载体在293A细胞中包装成功,获得成熟的病毒颗粒,测得病毒滴度为2.5×10~9pfu/ml,western blotting结果证实Ad-hBMP-2在293A细胞中高效表达hBMP-2蛋白,结论:本实验首次利用基于λ噬菌体的位点特异性重组系统的Gateway~(TM)技术成功构建了Ad-hBMP-2,该技术与传统构建方法比较具有高效性和灵活性,为进一步研究BMP-2的生理功能和利用BMP-2进行骨基因治疗奠定了实验基础。

• 单位
  四川大学华西口腔医学院