卵泡液中游离线粒体DNA提取和定量方法的研究

作者：刘宇; 赵雪; 邹敏; 邵淑敏; 李娇; 张衷源; 汪文诤; 张玲^*

来源：生殖医学杂志, 2018, 27(11): 1136-1141.

• 游离线粒体DNA
• 两步离心法
• 冷冻
• Q-PCR
• 卵泡液

目的探讨影响卵泡液中游离线粒体DNA(cfmtDNA)提取和定量的因素即卵泡液处理和冷冻储存、实时荧光定量PCR(Q-PCR)引物和试剂盒选择。方法收集2016年3月10月在华中科技大学同济医学院生殖医学中心进行IVF/ICSI的78名患者的卵泡液样本,分别用4种方法(一步离心法、两步离心法、两步离心法的基础上0.22μm及0.45μm过滤器过滤)对样本进行处理。处理后的样本一部分继续后续操作,一部分冷冻储存后再进行相应实验。用硅胶膜离心柱法,(如TIANamp Genomic DNA试剂盒)和磁珠法(如BeaverBeadsTM Circulating DNA试剂盒)分别提取样本DNA,进行Q-PCR,比较线粒体编码的基因ND1和hmito3为引物cfmtDNA定量的差异及相关性。结果一步离心法获得的cfmtDNA浓度显著高于其余三种方法(P<0.05),其余三种方法之间浓度无显著性差异(P>0.05);与冷冻前相比,冷冻后cfmtDNA浓度无显著性差异(P>0.05);ND1引物扩增cfmtDNA所得的浓度平均值显著高于hmito3引物扩增cfmtDNA所得的浓度平均值(P<0.05),ND1引物和hmito3引物扩增cfmtDNA所得的浓度显著相关(r=0.63,P<0.000 1);与TIANamp Genomic DNA试剂盒相比较,BeaverBeadsTMCirculating DNA试剂盒提取cfmtDNA的量显著增加(P<0.05)。结论卵泡液样本的处理方法、引物和试剂盒的选择都会影响卵泡液中cfmtDNA的定量。建议选用两步离心法处理卵泡液,磁珠法提取游离DNA,ND1引物进行cfmtDNA的定量。

• 单位
  华中科技大学同济医学院