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摘要
目的 研究斯氏按蚊肽聚糖识别蛋白S2 (PGRP?S2)的功能及其对按蚊体内共生菌稳态的影响。方法 将羽化后2～4日龄雌性斯氏按蚊分为对照组(喂食10%蔗糖溶液)、感染血组(叮咬原虫血症为4%～8%的伯氏疟原虫ANKA感染小鼠)和健康血组(叮咬健康小鼠)，每组60只，饱血24 h后分离中肠和其余组织，用Trizol法提取RNA，实时荧光定量PCR (RT?qPCR)检测pgrp-s2基因的相对转录水平。将羽化后0～1日龄雌性斯氏按蚊分为对照组(喂食10%蔗糖溶液)与抗生素处理组(喂食含有青霉素、链霉素和庆大霉素的10%蔗糖溶液)，每组30只，喂养5 d后分离中肠和其余组织，RT?qPCR检测pgrp-s2基因的相对转录水平。将雌性斯氏按蚊分为pgrp-s2敲低组和绿色荧光蛋白基因(gfp)对照组，每组60只，分别注射pgrp-s2的双链RNA (dsRNA)和gfp基因dsRNA (69 nl/只)，2 d后每组取蚊虫提取RNA,RT?qPCR检测pgrp-s2的相对转录水平，提取DNA并使用16S rRNA特异性引物PCR检测蚊虫体内共生菌总量。分别取30只pgrp-s2敲低组和gfp对照组按蚊，用107个/ml摩氏摩根氏菌液浸湿棉球喂养5 d后，提取RNA,RT?qPCR检测获得共生菌16S rRNA相对总量和摩氏摩根氏菌的相对数量；提取pgrp-s2敲低组和gfp对照组按蚊中肠组织RNA，转录组测序后进行聚类分析、京都基因与基因组百科全书(KEGG)功能注释和富集分析。使用SMART网站预测分析PGRP?S2氨基酸序列后利用CLC Main Workbench软件进行比对。克隆按蚊pgrp-s2基因，利用昆虫杆状病毒表达系统(pFastbacⅠ)在SF9细胞中表达PGRP?S2重组蛋白，Western blotting检测蛋白表达情况。取10、 20、 40μg/ml纯化后的PGRP?S2重组蛋白溶液(以蛋白缓冲液为对照)分别与40μg赖氨酸(Lys)型肽聚糖和二氨基庚氨酸(DAP)型肽聚糖孵育，每间隔12 h测定相对吸光度(A540值)以判定肽聚糖的降解情况，验证PGRP?S2的酰胺酶活性。结果RT?qPCR结果显示，吸血后24 h，感染血组、健康血组和对照组按蚊中肠pgrp-s2的相对转录水平分别为1 590.0±665.2、126.8±100.4和15.84±6.92，感染血组高于对照组(t=2.38, P <0.05)；对照组按蚊中肠的pgrp-s2的相对转录水平高于其余组织(1.71±0.51)(t=2.04, P <0.05)。抗生素处理组按蚊中肠pgrp-s2的相对转录水平为0.33±0.18，低于对照组的117.9±54.5 (t=2.16,P <0.05)。pgrp-s2敲低组按蚊体内共生菌16S rRNA相对总量为3 653±2 023，低于gfp对照组的14 982±3 892(t=2.58, P <0.05)；摩氏摩根氏菌饲喂后，pgrp-s2敲低组按蚊体内摩氏摩根氏菌的相对数量为571 517±61 258，低于gfp对照组的919 754±123 397 (t=2.53,P <0.05)。转录组分析结果显示，pgrp-s2敲低可以上调按蚊免疫相关的Toll/Imd通路、 mTOR通路、 FoxO通路基因，下调脂肪酸代谢、三羧酸循环等代谢相关基因。10、 20、 40μg/ml PGRP?S2重组蛋白与DAP型肽聚糖孵育48 h后，相对A540值分别为0.49±0.07、 0.40±0.10和0.44±0.07，均低于对照的0.90±0.09 (t=3.53、3.65、3.97，均P <0.05)；但与Lys型肽聚糖孵育48 h后，相对A540值分别为0.52±0.03、 0.62±0.03和0.65±0.04，与对照(0.64±0.05)的差异均无统计学意义(t=1.95、 0.31、 0.11，均P> 0.05)。结论斯氏按蚊体内pgrp-s2主要在中肠表达，且表达水平受共生菌调控。PGRP?S2重组蛋白可以降解DAP型肽聚糖，具有酰胺酶活性，可通过负调节免疫反应和调节代谢反应调控按蚊体内共生菌水平。
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单位生命科学学院; 复旦大学
