ITGA5慢病毒shRNA表达载体及Bel-7404稳定细胞系的构建

作者：郭亚妹; 孙昊; 何彩霞; 杨小利; 杨少奇

来源：宁夏医科大学学报, 2018, 40(03): 249-260.

DOI：10.16050/j.cnki.issn1674-6309.2018.03.001

• 整合素α5基因
• 短发卡shRNA
• 慢病毒表达载体
• 肝癌

目的构建整合素α5基因(ITGA5)的短发卡RNA(shRNA)慢病毒表达载体,并建立稳定沉默ITGA5表达的肝癌细胞系Bel-7404。方法设计3条ITGA5基因特异性shRNA靶序列和1条非特异性序列作为阴性对照(NC),分别克隆到GV493质粒载体中,转化感受态细胞后挑取阳性克隆子进行DNA测序鉴定,包装成重组慢病毒,并纯化、测定病毒滴度。将4组慢病毒载体分别感染人肝癌细胞Bel-7404,使用嘌呤霉素筛选后,在荧光显微镜下观察GFP的表达,q PCR和Western blot分别检测各组中ITGA5的基因和蛋白质表达水平。结果 ITGA5基因shRNA慢病毒表达载体经过测序鉴定构建成功,q PCR和Western blot检测结果显示3种慢病毒干扰组的ITGA5表达水平均低于NC组(P均<0.05)。NC组m RNA的表达量为(100±2.3)%,ITGA5-shRNA-1、ITGA5-shRNA-2、ITGA5-shRNA-3组m RNA相对表达量分别为(10.7±3.7)%、(16.7±1.5)%、(11.8±2.9)%,且其干扰效率均达到70%以上,可选择其中一个干扰靶点进行后续实验。结论成功构建ITGA5基因shRNA慢病毒表达载体,感染肝癌Bel-7404细胞并成功筛选出稳定沉默细胞系,为进一步研究ITGA5在肝癌中的生物学功能和作用机制提供了实验基础。

• 单位
  宁夏医科大学; 宁夏医科大学总医院; 宁夏回族自治区人民医院