番茄环纹斑点病毒N和NSm基因的VIGS载体构建

作者：崔玥; 赵立华; 陈思; 文俊元; 邱润霜; 张仲凯; 赵明富^*

来源：西南农业学报, 2023, 36(01): 98-104.

DOI：10.16213/j.cnki.scjas.2023.1.012

• 番茄环纹斑点病毒
• 病毒诱导的基因沉默
• 实时荧光定量PCR
• 烟草脆裂病毒

【目的】番茄环纹斑点病毒(Tomato zonate spot orthotospovirus, TZSV)由传毒介体蓟马以持久增殖型方式传播，且能与其他病毒复合侵染作物，对中国西南地区重要蔬菜的产量和观赏作物的品质造成严重影响，给当地农业生产带来了严重危害。TZSV的N和NSm基因与病毒分类、运动和系统侵染密切相关。本研究通过构建N和NSm基因沉默载体，以期为进一步研究TZSV N和NSm基因在病毒侵染方面的功能提供材料，为抗病育种以及田间绿色防控提供一些依据。【方法】根据TZSV N和NSm基因序列设计特异性引物，利用RT-RCR技术扩增得到TZSV N和NSm基因片段，将扩增得到的目的基因连接到pEASY-Blunt-Zero载体上，含有N和NSm基因序列的pEASY-Blunt-Zero载体和pTRV-pTV00载体用Bam HI和Hind III限制性内切酶进行双酶切，并将酶切产物进行纯化回收，纯化后产物与pTRV-pTV00载体使用T4 DNA连接酶连接，获得pTRV-PTV00-N和pTRV-PTV00-NSm重组载体，将其转入根癌农杆菌GV3101中，并注射到本氏烟和栽培烟K326中，通过实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测病毒N和NSm基因的沉默效率，间接酶联免疫吸附试验(ID-ELISA)检测N和NSm蛋白的含量。【结果】RT-qPCR分析表明，本生烟和栽培烟K326中N和NSm基因在接种TZSV后5 d沉默效率均大于90%。ID-ELISA结果显示，2个蛋白含量在不同时间内均显著下降，其中NSm蛋白含量连续9 d显著下降。【结论】TZSV N和NSm基因沉默载体构建成功，并成功试验于本氏烟和栽培烟K326。通过构建TZSV N和NSm基因沉默载体，为研究TZSV致病机理提供了材料，为田间抗TZSV育种和防控提供了理论依据。

• 单位
  云南农业大学; 云南省农业科学院生物技术与种质资源研究所