人蛋白激酶CK2α′亚基在大肠杆菌中的克隆、表达及其重组蛋白的纯化与性质鉴定

作者：陈小文; 刘新光; 梁景耀; 梁念慈

来源：中国生物化学与分子生物学报, 2004, 20(2): 176-182.

DOI：10.3969/j.issn.1007-7626.2004.02.007

• 人蛋白激酶CK2α′亚基
• 克隆
• pT7-7
• GST融合表达
• 蛋白纯化

通过RT-PCR从HL-60细胞获得人蛋白激酶CK2α′亚基编码区cDNA,将Nde I/HindⅢ双酶切的PCR产物和pT7-7表达载体进行定向克隆、细菌转化、电泳初筛和限制性酶切分析鉴定.随机挑选阳性克隆进行DNA测序确证,筛选含与已知序列完全相符的重组质粒(命名为pTCKA′).将其转化BL21(DE3)菌,IPTG诱导后未见高效特异表达.然后将人CK2α′cDNA亚克隆至GST融合蛋白表达载体,经同样转化和诱导步骤后可见一蛋白特异高效表达.Western印迹结果证明:该蛋白能与兔抗人CK2α′333-350肽段抗血清发生特异性免疫反应.采用GSH-Sepharose 4B柱纯化,凝血酶酶切,最后从4 g细菌获4.4 mg纯化重组蛋白.通过性质鉴定和酶动力学分析证明:克隆、表达和纯化的重组蛋白是有生物学活性的人CK2α′亚基.

• 单位
  深圳市儿童医院; 广东医科大学