CRISPR/Cas9系统靶向敲除多溴蛋白1基因对肝癌细胞功能的影响

作者：宋金鸽; 焦宇辰^*

来源：临床内科杂志, 2020, 37(04): 300-304.

DOI：10.3969/j.issn.1001-9057.2020.04.017

• CRISPR/Cas9
• 基因敲除
• 多溴蛋白1
• Huh7细胞系

目的探讨应用规律成簇的间隔短回文重复(CRISPR)/CRISPR相关蛋白9(Cas9系统靶向敲除多溴蛋白1(PBRM1)基因对肝癌细胞功能的影响。方法应用CRISPR/Cas9系统靶向敲除Huh7细胞的PBRM1基因。采用Sanger测序和蛋白质印迹法(Western blot)检测基因敲除情况。基于转录本测序(RNA-seq)结果,对Huh7敲除(KO)细胞株与Huh7野生(WT)细胞系差异表达基因进行功能富集。采用流式细胞术分析细胞周期的改变。通过CCK-8法和克隆形成实验研究细胞增殖情况。采用不同浓度的γ-干扰素(IFN-γ)处理Huh7-KO细胞株和Huh7-WT细胞系,验证GO富集中IFN-γ应答通路的改变。结果成功构建PBRM1基因敲除的Huh7细胞株。Huh7-KO细胞株的生长曲线和克隆形成率均显著慢于Huh7-WT细胞系(P <0.000 1)。Huh7-KO细胞株中下调基因主要与细胞周期相关,上调基因主要与免疫应答相关。Huh7-KO细胞株处于G1期的细胞比例明显高于Huh7-WT细胞系(P=0.016 6),而处于S期的细胞比例明显低于Huh7-WT细胞系(P=0.000 2)。浓度为1 000 U/ml的IFN-γ对Huh7-KO细胞株组的细胞抑制作用明显高于Huh7-WT细胞系组(P=0.009 1)。结论在Huh7肝癌细胞株中敲除PBRM1可以导致G1/S阻滞从而抑制细胞增殖。高浓度IFN-γ可以更加有效地杀伤PBRM1缺失的肿瘤细胞。

• 单位
  中国医学科学院肿瘤医院; 分子肿瘤学国家重点实验室; 北京协和医学院