APOBEC3F的真核表达及其抗猪繁殖与呼吸综合征病毒作用的分析

作者：胡璇; 田浪; 王怡然; 温贵兰^*; 陈启青; 陈佳琪; 叶泥; 龚新勇

来源：中国预防兽医学报, 2023, 45(08): 829-836.

• 猪繁殖与呼吸综合征病毒
• 载脂蛋白B mRNA编辑酶催化多肽样3F
• Marc-145细胞

为研究载脂蛋白B mRNA编辑酶催化多肽样3F (APOBEC3F)对猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)增殖的影响，本研究根据GenBank中登录的猪源APOBEC3F基因序列(EU871586)设计引物，经PCR从苏太猪外周血单个核淋巴细胞中扩增APOBEC3F基因，经测序后构建系统进化树分析其遗传进化特性。结果显示，猪源APOBEC3F基因编码区(CDS)长1 257 bp，编码418个氨基酸，与其他物种该基因的同源性在60%～70%。利用扩增的APOBEC3F基因构建真核表达载体pcDNA3.1(+) 5’Flag-APOBEC3F经菌液PCR和测序鉴定正确后，转染Marc-145细胞，采用间接免疫荧光试验(IFA)和western blot鉴定重组APOBEC3F蛋白的表达。IFA结果显示，转染pcDNA3.1(+)5’Flag-APOBEC3F的Marc-145细胞质中出现特异性红色荧光；western blot结果显示，转染pcDNA3.1 (+) 5’FlagAPOBEC3F的细胞样品在44 ku处有特异性条带，表明猪源APOBEC3F在Marc-145细胞中获得了表达。在Marc-145细胞中转染不同剂量的pcDNA3.1(+) 5’Flag-APOBEC3F或不同剂量的针对APOBEC3F的siRNA，过表达或抑制APOBEC3F表达后感染PRRSV，通过RT-q PCR检测PRRSV N基因mRNA的转录水平，采用western blot检测细胞中PRRSV N蛋白的表达水平，采用TCID50测定PRRSV滴度。结果显示，在Marc-145细胞中过表达的APOBEC3F可以显著抑制PRRSV N基因mRNA转录水平(P<0.01)和N蛋白的表达水平，降低PRRSV滴度(P<0.01、P<0.001)，表明APOBEC3F具有抑制PRRSV增殖的作用，且抑制效率与重组质粒的转染剂量呈正相关。在Marc-145细胞中抑制APOBEC3F的表达后，PRRSV N基因的mRNA转录水平(P<0.01)、N蛋白的表达水平与PRRSV滴度(P<0.05、P<0.001)均显著升高，表明抑制APOBEC3F的表达具有促进PRRSV增殖的作用，且该促进效率与针对APOBEC3F的si RNA转染剂量呈正相关。本研究首次证明APOBEC3F对PRRSV在Marc-145细胞中的增殖有抑制作用，为研究APOBEC3F功能提供实验依据，也为研究抗PRRSV相关机制的研究提供参考。

• 单位
  贵州大学; 动物科学学院