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摘要
目的探讨微小RNA(miRNA)-181b-5p是否通过靶向普列克底物蛋白(PLEK)抑制皮肤黑素瘤(CM)细胞的增殖及侵袭能力。方法生物信息学分析CM核心基因;双荧光素酶报告基因实验验证miRNA-181b-5p和PLEK的靶向结合。采用RNA oligo和siRNA分别调控A375细胞miRNA-181b-5p和PLEK的表达, 具体分组为:模拟物阴性对照组、miRNA-181b-5p模拟物组、抑制剂阴性对照组、miRNA-181b-5p抑制剂组、PLEK siRNA组、siRNA阴性对照组、miRNA-181b-5p抑制剂和对照siRNA共转染组以及miRNA-181b-5p抑制剂和PLEK siRNA3共转染组。上述各组用相应试剂处理细胞48 h后, 采用qPCR检测A375细胞中miRNA-181b-5p和PLEK mRNA的表达, Western印迹检测PLEK蛋白的表达, Transwell小室侵袭实验检测A375细胞的侵袭能力;继续培养24 ～ 96 h后, CCK8实验检测A375细胞增殖能力。结果 PLEK为CM的核心基因, CM原位癌组织较癌旁组织高表达PLEK(P = 0.031), 转移组织较原位癌组织高表达PLEK(P = 0.001)。与人表皮黑素细胞HEMa-LP相比, A375细胞高表达PLEK mRNA(3.884 ± 0.156比0.997 ± 0.010, t = 18.48, P < 0.001)及PLEK蛋白(2.840 ± 0.301比1.029 ± 0.094, t = 5.47, P = 0.005), 低表达miRNA-181b-5p(0.333 ± 0.042比0.967 ± 0.069, t = 7.83, P = 0.001)。双荧光素酶报告基因实验显示, miRNA-181b-5p和PLEK靶向结合。与模拟物阴性对照相比, miRNA-181b-5p模拟物转染后A375细胞的存活率显著降低(48 h, t = 7.96, P = 0.015;72 h, t = 7.50, P = 0.002;96 h, t = 7.96, P = 0.001), 侵袭能力也显著降低(t = 5.07, P = 0.007);相反miRNA-181b-5p抑制剂组A375细胞存活率高于抑制剂阴性对照组(24 h, t =5.38, P = 0.013;48 h, t = 5.36, P = 0.013;72 h, t =7.63, P = 0.005;96 h, t =5.99, P = 0.004), 侵袭能力也高于抑制剂阴性对照组(t = 7.24, P = 0.002);与对照siRNA组相比, PLEK siRNA转染后A375细胞的增殖能力降低(48、72、96 h时, P值分别为0.015、0.011、0.001), 侵袭能力也降低(t = 4.93, P = 0.008);与miRNA-181b-5p抑制剂和对照siRNA共转染组相比, miRNA-181b-5p抑制剂和PLEK siRNA共转染组A375细胞的增殖率明显降低(24、48、72、96 h时, P值分别为0.042、0.042、0.037、0.017), 侵袭能力也明显降低(t = 8.52, P = 0.001)。结论 miRNA-181b-5p抑制A375细胞增殖和侵袭能力, 其机制涉及靶向下调PLEK的表达。
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