病毒性出血性败血症病毒数字PCR检测方法的建立

作者：肇慧君; 胡强; 于灵; 吴斌; 易佳颖

来源：水产科学, 2023, 1-14.

DOI：10.16378/j.cnki.1003-1111.21245

• 病毒性出血性败血症病毒
• 数字PCR
• 实时荧光定量RT-PCR
• 水产品

为建立病毒性出血性败血症病毒精准快速检测方法，笔者以病毒性出血性败血症病毒基因组特异保守的糖蛋白基因片段为靶目标，设计合成了特异性引物及探针，优化退火温度等关键反应条件，分别进行灵敏性试验、特异性试验及重现性试验，构建病毒性出血性败血症病毒数字PCR检测技术体系，同时，与实时荧光定量RT-PCR方法进行对比分析。试验结果显示，病毒性出血性败血症病毒数字PCR最佳退火温度为58.5 ℃。灵敏性试验显示，随着病毒性出血性败血症病毒基因组RNA连续10倍稀释，稀释至105倍数时，数字PCR体系仍可以检测到阳性微滴，因此，确定RNA基因组核酸含量19拷贝/μL为病毒性出血性败血症病毒数字PCR的检测低限。特异性试验表明，该方法只与目标病毒病毒性出血性败血症病毒有特异性扩增，与传染性胰脏坏死病毒、传染性造血器官坏死病毒、鲤春病毒血症病毒、流行性造血器官坏死病毒、牙鲆弹状病毒、病毒性神经坏死病毒、锦鲤疱疹病毒、鲤浮肿病毒、真鲷虹彩病毒、淋巴囊肿病毒等10种病毒均无扩增反应。重复性试验表明，病毒性出血性败血症病毒数字PCR批内与批间试验的变异系数均小于1%，具备良好的重复性。利用构建的数字PCR方法，对收集到的国内及进境鱼类样品共计1210批次进行病毒性出血性败血症病毒检测，结果显示，数字PCR阳性样本检出率为9.5%，常规实时荧光定量RT-PCR阳性样本检出率为7.69%～7.77%。临床试验结果表明，研究建立的病毒性出血性败血症病毒数字PCR方法较常规技术具有更高的检测灵敏性，适用于水生动物疫病精准检测的需求。

• 单位
  上海海洋大学