Wilms瘤基因1低表达和过表达乳腺癌细胞模型的建立

作者：齐晓伟; 杨新华; 张毅; 范林军; 张帆; 陈莉; 唐振宁; 张彦; 杨晓宁; 宗贝歌; 胡保全; 王明浩; 姜军

来源：中华乳腺病杂志(电子版), 2013, 7(04): 238-244.

• Wilms瘤基因1
• RNA干扰
• RNA激活
• 乳腺肿瘤

目的应用RNA干扰(RNAi)和RNA激活(RNAa)技术,分别构建小干扰RNA(siRNA)和双链RNA(dsRNA),建立Wilms瘤基因1(WT1)低表达和过表达的乳腺癌细胞模型。方法以国外学者提供的3条序列(siRNA-516、siRNA-803、siRNA-1029)构建WT1 siRNA干扰表达WT1,以研究已证实可上调WT1表达的序列(dsRNA-319)构建dsRNA过表达WT1,通过脂质体(LipofectamineTM2000)分别将siRNA和dsRNA转入MDA-MB-321和MCF-7细胞。WT1有效siRNA筛选实验分为6组:WT1siRNA-516、WT1 siRNA-803、WT1 siRNA-1029、阴性对照、脂质体组和空白细胞组;观察转染效率的时间点为转染后24、48、72 h。WT1 dsRNA的筛选实验分为3组:WT1 dsRNA-319、阴性对照组和空白细胞组;观察转染效率的时间点为转染后48、72、96 h。通过实时定量PCR(qRT-PCR)和Western Blotting筛选作用效果最明显的siRNA和dsRNA。使用单因素方差分析进行统计学分析。结果成功构建WT1siRNA-516、WT1 siRNA-803和WT1 siRNA-1029共3个siRNA,并转染到MDA-MB-231细胞中,转染效率达90%以上。上述3个WT1 siRNA均能够抑制WT1 mRNA和蛋白的表达,以转染后48 h WT1 siRNA-1029的效果最为显著[WT1 siRNA-1029组WT1 mRNA表达水平与空白细胞组相比显著降低(0.49±0.02比1.00±0.08,P=0.00),其蛋白表达水平也明显降低]。成功将WT1 dsRNA-319转染到MCF-7细胞中,转染效率达90%以上。50μmol/L的WT1 dsRNA-319转染后96 h,MCF-7细胞的WT1过表达最为显著[WT1 dsRNA-319组的WT1 mRNA表达水平与空白细胞组相比显著升高(319.06±14.84比1.00±0.07,P=0.00),其蛋白表达水平也明显升高]。结论成功建立低表达WT1的MDA-MB-231细胞和过表达WT1的MCF-7细胞模型,为后续进一步研究WT1在乳腺癌中的生物学行为奠定了基础。

• 单位
  第三军医大学西南医院