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摘要
目的 探讨转移性肝癌患者血清中外泌体对肝癌细胞HepG2上皮间质转化(EMT)的影响及与转化生长因子-β(TGF-β)通路的关联性。方法 收集广西医科大学第一附属医院2018-01-01-2021-11-30 5例TNMⅠ非转移性和15例TNMⅣ转移性肝癌患者血清作为对照组和实验组。运用超速离心法提取血清中外泌体，使用透射电镜、纳米颗粒跟踪技术(Nanosight)和蛋白质印迹进行鉴定，将血清、外泌体和去外泌体血清分别与HepG2共培养，使用倒置显微镜观察细胞形态变化，依照形态学改变划分为发生EMT转化和未发生EMT转化。蛋白质印迹和实时荧光定量聚合酶链反应法(RT-qPCR)检测上/间皮标志物、TGF-β通路分子，酶联免疫吸附法(ELISA)检测TGF-β1含量。应用Kaplan-Meier分析TGF-β通路介导的EMT对转移性肝癌患者预后的影响。结果 透射电镜、Nanosight和蛋白质印迹结果提示，超速离心法能较好分离血清外泌体。与HepG2共培养后，对照组肝癌细胞均未发生形态学改变，实验组中有10例血清和8例外泌体使癌细胞发生长梭形改变。蛋白质印迹结果显示，E-cadherin在空白组(0.596 9±0.001 8)、对照组(0.594 4±0.002 4)和实验组(0.589 6±0.009 2)中未发生EMT转化的相对蛋白表达量差异无统计学意义，F=2.865,P>0.05。实验组中血清和外泌体诱导发生EMT转化的E-cadherin相对蛋白表达量(0.340 9±0.017 5)低于未发生EMT转化(0.589 6±0.009 2),差异有统计学意义，t=-55.50,P<0.05。N-cadherin在空白组(0.449 1±0.007 0)、对照组(0.449 9±0.005 8)和实验组(0.452 9±0.031 7)中未发生EMT转化的相对蛋白表达量差异无统计学意义，F=0.085,P>0.05。实验组中发生EMT转化的N-cadherin相对蛋白表达量(0.787 3±0.023 8)高于未发生EMT转化(0.452 9±0.031 7),差异有统计学意义，t=38.12,P<0.05。空白组(0.218 8±0.009 8)、对照组(0.214 5±0.007 8)和实验组(0.216 9±0.011 6)未发生EMT转化中磷酸化Smad3(p-Smad3/t-Smad3)的相对蛋白表达量差异无统计学意义，F=0.358,P>0.05。磷酸化Smad3相对蛋白表达量在实验组中发生EMT转化(0.389 9±0.030 3)与未发生EMT转化(0.216 9±0.011 6)比较，差异有统计学意义，t=23.06,P<0.05。RT-qPCR结果显示，E-cadherin相对表达量在空白组(1.020 0±0.046 8),对照组(1.01 7±0.034 4)和实验组(1.000 0±0.038 0)中未发生EMT转化的比较差异无统计学意义，F=0.427,P>0.05。与对照组(1.076 0±0.057 3)比较，空白组(1.074 0±0.036 4)和实验(1.043 0±0.078 7)组中未发生EMT转化的N-cadherin相对表达量差异无统计学意义，F=1.135,P>0.05。E-cadherin在实验组中诱导发生EMT转化的相对表达水平(0.633 5±0.004 2)低于未发生EMT转化，差异有统计学意义，t=-49.63,P<0.05。而在实验组中诱导发生EMT转化的N-cadherin相对表达水平(2.383 0±0.145 9)明显高于未发生EMT转化，差异有统计学意义，t=35.65,P<0.05。ELISA检测结果发现，实验组中能诱导发生EMT转化的血清(2 459.9±349.6)μg/L和外泌体(183.8±44.5)μg/L中TGF-β1蛋白表达量均高于未发生EMT转化的血清(1 361.0±192.4)μg/L和外泌体(73.0±15.0)μg/L,差异有统计学差异，均P<0.05。生存分析结果表明，血清和外泌体通过TGF-β1/Smad3信号通路介导发生EMT转化的转移性肝癌患者无转移中位生存期(125、122 d)均少于未发生EMT转化(193、187 d),差异有统计学意义，Log-rank检验统计量值分别为4.263、4.126,P值分别为0.039、0.042。结论 转移性肝癌血清中外泌体可通过TGF-β1/Smad3信号通路在癌细胞上皮间质转化的发生过程中发挥重要作用，与患者的不良预后有关。
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单位公共卫生学院; 广西医科大学; 基础医学院; 广西医科大学第一附属医院
