结核分枝杆菌ESAT6-CFP10融合蛋白的原核表达及其表达条件的优化

作者：杨晰朦; 陈香梅^*

来源：中国生物制品学杂志, 2020, 33(03): 286-292.

DOI：10.13200/j.cnki.cjb.003008

• 结核分枝杆菌
• ESAT6
• CFP10
• 基因重组
• 蛋白表达
• 稳定性

目的原核表达结核分枝杆菌(Mycobacterium tuber-culosis,MTB)ESAT6-CFP10融合蛋白(recombinant ESAT6-CFP10,rEC),并优化表达条件。方法以(GGGGS)3为linker将ESAT6和CFP10两个基因连接,合成rEC全基因,插入至载体pET-28a,构建重组质粒pET-28a-rEC,转化至感受态E. coli BL21(DE3),筛选优势菌株进行诱导表达,并对诱导温度(25、30、37℃)、诱导剂种类及浓度(0. 05、0. 1、0. 2、0. 5、1. 0 mmol/L IPTG及0. 5、1、5、10、15、20 g/L乳糖)、诱导时间(2、3、4、5、6 h)、诱导起始A600(0. 4、0. 6、0. 8、1. 0)进行优化。菌种经5 L发酵罐发酵培养后,采用亲和层析及离子交换层析纯化rEC融合蛋白,于-20℃分别储存0、2、4、6个月,12. 5%SDS-PAGE分析rEC融合蛋白,并对保存0、6月的样品进行HPLC-SEC分析。结果重组质粒pET-28a-rEC经双酶切及测序鉴定,构建正确。rEC融合蛋白最适诱导条件为:于30℃,以0. 1 mmol/L IPTG诱导4 h。纯化后rEC融合蛋白纯度达95%以上,且可与鼠抗ESAT6单克隆抗体发生特异性结合,于-20℃保存6个月未见蛋白降解及聚体产生。结论原核表达了rEC融合蛋白,并优化了其表达条件,获得的rEC融合蛋白具有较高纯度及稳定性。

• 单位
  北京大学; 基础医学院