猪源嗜血支原体三重TaqMan探针荧光定量PCR方法建立和应用

作者：付媛^*; 石团员; 袁秀芳; 徐丽华; 孙洪超; 韦强

来源：农业生物技术学报, 2022, 30(06): 1228-1236.

• 猪支原体
• 微小支原体
• 新种嗜血支原体
• 嗜血支原体
• 荧光定量PCR
• 附红细胞体病

猪附红细胞体病是由猪支原体(Mycoplasma suis)、微小支原体(M. parvum)和浙江分离到的待定新种嗜血支原体(Candidatus M. haemosuis, CMh)引起猪(Sus Scorfa)传染性贫血、黄疸和母猪流产等症状的疾病。3种病原在我国猪群中的流行和传播情况不明，为鉴别诊断3种猪源嗜血支原体和了解该类病原在我国猪群中的流行特点，本研究建立了1种基于甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH)基因的三重TaqMan探针荧光定量PCR (qPCR)鉴别检测方法。根据已知的3种猪源嗜血支原体GAPDH基因序列，利用Beacon Designer 4.0软件分别设计特异性引物和探针。通过分别优化Mg2+浓度、热启动酶浓度、引物和探针浓度等反应条件，建立了三重TaqMan探针qPCR方法，并验证了该法的特异性、敏感性和重复性。结果表明，建立的三重TaqMan探针qPCR方法标准曲线相关系数R2在0.999 2～0.999 6之间，扩增效率在99.9%～103.2%之间；该法对其他常见猪病无扩增信号，具有良好的特异性；该法对3种猪源嗜血支原体的最低检测限均为1 copy/μL；组内和组间变异系数在0.31%～1.75%之间，表明重复性好。应用该法对浙江省148份猪抗凝血样品检测并与二重PCR符合比较，结果显示三重Taqman探针qPCR检测M. suis、M. parvum和CMh的阳性率分别为50%(74/148)、48.6%(72/148)和64.9%(96/148),3种病原的混合感染率为29.7%(44/148)；二重PCR方法检测M. suis/M. parvum和CMh阳性率分别为29.1%(43/148)和15.5%(23/148)，二重PCR阳性样品三重qPCR检测均阳性。本研究建立的方法可用于临床上M. suis、M.parvum和CMh的鉴别诊断，为猪源嗜血支原体病的流行病学调查和防控提供技术支撑。

• 单位
  浙江省农业科学院