抗SARS-CoV-2刺突糖蛋白受体结合域单链抗体的筛选及鉴定

作者：金佳佩; 蔡雪飞^*

来源：中国生物制品学杂志, 2023, 36(03): 295-305.

DOI：10.13200/j.cnki.cjb.003848

• 严重急性呼吸综合征冠状病毒2
• 单链抗体
• 刺突糖蛋白
• 受体结合域
• 噬菌体文库

目的 构建抗严重急性呼吸综合征冠状病毒2(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS-Co V-2)刺突糖蛋白(spike protein,S)受体结合域(receptor-binding domain,RBD)的单链抗体(single-chain fragment variable,scFv)噬菌体展示文库，筛选特异性scFv，并进行功能鉴定。方法 提取RBD蛋白免疫小鼠的脾细胞m RNA，逆转录为c DNA，以其为模板扩增scFv的重链可变区(hight chain fragment of variable,VH)和轻链可变区(light chain fragment of variable,VL)基因，经过重叠延伸PCR扩增(splicing overlap extension PCR,SOE-PCR)组装为scFv基因片段。将scFv基因片段插入噬菌体载体，构建scFv噬菌体展示文库。经4轮生物淘洗，筛选出与RBD结合能力较强的scFv基因，进行重组表达、纯化和生物活性鉴定。结果 构建的scFv噬菌体文库滴度为6.0×1011pfu/m L。经4轮生物淘选后，共筛选出4株与RBD结合较强的scFv，分别为scFv11、scFv12、scFv25、scFv28。scFv相对分子质量约为27 000，多以包涵体形式存在，纯化后可与HRP标记的鼠抗His单克隆抗体发生特异性结合，浓度达2.4 mg/m L，纯度约90%。4株scFv均可与RBD重组蛋白发生特异性结合；除scFv28外，其他3株scFv均可与野生型和多突变株S蛋白结合；与RBD均存在剂量依赖性相互作用，亲和力动态拟合解离常数(KD)分别为8.9、5.92、10.67、2.36 nmol/L，稳态拟合解离常数(KD)分别为5.3、6.5、8.7、5.8 nmol/L;scFv11、scFv12和scFv25可同时识别3个独立的RBD多肽，包括RBD2(S334～353)、RBD9(S439～458)和RBD13(S499～518)；在线服务器SWISS-MODEL对scFv进行同源建模的模型质量良好，可用于分子对接；scFv11及人肺泡上皮细胞表面血管紧张素转换酶2(human angiotensin converting enzyme 2,ACE2)与RBD相互作用的界面仅部分重合，scFv12和scFv25与RBD的相互作用界面和ACE2与RBD相互作用界面存在较大差异。结论 本研究通过构建抗SARS-Co V-2 RBD的scFv噬菌体文库，筛选并制备了可与SARS-Co V-2 RBD特异结合的scFv，为进一步抗SARS-Co V-2药物和检测试剂的研发提供了实验依据。

• 单位
  重庆医科大学