鼠Fscb/Cabyr双基因靶向敲除动物模型的建立和鉴定

作者：李中泰; 李彦锋^*; 刘晋祎; 张勇; 张军; 毕罡

来源：第三军医大学学报, 2020, 42(19): 1898-1906.

DOI：10.16016/j.1000-5404.202005029

• 基因敲除
• 精子鞭毛
• CRISPR/Cas9系统
• 动物模型

目的利用CRISPR/Cas9系统构建鼠Fscb/Cabyr双基因靶向敲除小鼠模型,为研究鼠FSCB和CABYR蛋白复合物在精子鞭毛运动和获能中作用奠定基础。方法根据Cabyr基因全长序列,设计CRISPR/Cas9作用靶点,合成4条单链向导RNA(single-guide RNA,sgRNA),克隆入pUC57-T7-gRNA表达载体,获得sgRNA表达质粒。sgRNA和Cas9 mRNA体外转录后,将Cas9 mRNA和sgRNA以适当比例混合并注入C57BL/6J小鼠受精卵中,获得Cabyr基因敲除的初建鼠(F0)。PCR鉴定后,选取两只嵌合体雌鼠与背景鼠回交繁育,获得靶基因敲除F1杂合鼠,将其与前期已经建立的Fscb杂合鼠交叉繁育,获得Fscb/Cabyr(--/--)双基因敲除纯合子小鼠。通过Western blot和免疫荧光检测双基因敲除后小鼠精子中FSCB/CABYR蛋白的表达情况。结果首先获得7只(3只雄鼠,4只雌鼠)删除Cabyr基因片段并产生移码的F1代杂合鼠,将F1代杂合雄鼠与雌鼠交配,获得Cabyr基因敲除纯合子小鼠。同时,以Fscb杂合小鼠与Cabyr杂合小鼠通过反复交叉繁育,最终获得Fscb/Cabyr(--/--)双基因敲除纯合子小鼠。Western blot检测证实双基因敲除纯合子雄鼠睾丸及精子内FSCB和CABYR蛋白表达均消失,免疫荧光检测显示精子主段内无FSCB、CABYR蛋白荧光表达。结论应用CRISPR/Cas9系统和杂合子交叉繁育成功获得Fscb/Cabyr(--/--)双基因敲除纯合子小鼠,为进一步研究FSCB和CABYR蛋白复合物的功能奠定了动物模型基础。

• 单位
  大坪医院; 第三军医大学; 中国人民解放军陆军军医大学