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摘要
本研究基于UNG酶的生物学特性（能特异性识别并切割DNA分子中出现的尿嘧啶核苷），在PCR反应体系中引入UNG酶，使用农业农村部172号公告推荐的荧光定量PCR方法的引物和探针，通过对上下游引物、探针、Taq酶等反应体系的优化，建立防污染的恒温隔绝式荧光PCR(iiPCR)检测方法。结果显示：优化后的iiPCR方法特异性好，只扩增出ASFV的特异片段，对猪瘟病毒、高致病性蓝耳病病毒、伪狂犬病毒、流行性乙型脑炎病毒、猪细小病毒、猪流行性腹泻病毒等病原不能检出，检测下限为25.5拷贝/μL；具有良好的稳定性，组内和组间变异系数均<5%。该方法对实验室环境及操作人员的要求不严格，对PCR反应的反应性、便捷性和时效性无影响，也不影响后续实验，同时可以解决阳性对照物及扩增产物对PCR扩增体系污染的问题，减少假阳性的出现，提高检测方法的可靠性，为ASFV的诊断提供了可靠的手段。
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