多聚磷酸盐激酶双底物通道腔的理性设计及其在无细胞催化生产谷胱甘肽中的应用

作者：高惠; 王晴; 刘婷婷; 徐美娟^*; 饶志明

来源：生物工程学报, 2023, 39(08): 3318-3335.

DOI：10.13345/j.cjb.230016

• 多聚磷酸盐激酶
• ATP再生
• 突变
• 无细胞催化
• 谷胱甘肽

三磷酸腺苷(adenosinetriphosphate,ATP)是一种重要的辅助因子，参与许多需能的生物催化反应。多聚磷酸盐激酶(polyphosphatekinases,PPK)由于其底物聚磷酸盐廉价易得，可以为消耗ATP的反应提供能量。本研究选择哈氏噬纤维菌(Cytophagahutchinsonii)来源的Ch PPK，进行了底物谱和耐受性分析，通过分子对接和定点突变，理性改造多聚磷酸盐激酶的双底物通道腔来提高PPK酶的催化活性。与野生型相比，筛选得到突变体Ch PPKK81H-K103V的相对酶活提高了326.7%，同时，双突变扩大了Ch PPK的底物利用范围与耐受性，提高了该酶的耐热性与耐碱性。基于该ATP再生系统，本研究偶联谷胱甘肽双功能酶GshAB和Ch PPKK81H-K103V，破细胞后采用无细胞催化生产谷胱甘肽，加入5 mmol/L ATP后，该体系6 h可以生产(25.4±1.9) mmol/L的谷胱甘肽，比突变前的催化体系提高了41.9%。优化无细胞催化体系的缓冲液、裂解液菌体量、补料时间后，无细胞体系可产生(45.2±1.8)mmol/L谷胱甘肽，底物L-半胱氨酸的转化率达到90.4%。提高Ch PPK生产ATP的能力，可有效增强底物的转化率，降低催化成本，实现了无细胞催化生产谷胱甘肽的高产量、高转化率与高经济价值的统一。本研究提供了一种绿色高效的ATP再生系统，可为消耗ATP的生物催化反应平台提供可持续动力。

• 单位
  烟台欣和企业食品有限公司; 江南大学; 工业生物技术教育部重点实验室; 生物工程学院