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摘要
目的探讨左卡尼汀对草酸钙诱导肾小管上皮细胞(HK-2)铁死亡的影响。方法采用蛋白质印迹法检测不同浓度(0、2、4、8 mmol/L)草酸钙对HK-2细胞铁死亡相关蛋白长链脂酰辅酶A合成酶4(ACSL4)、胱氨酸转运蛋白系统(XCT)和谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)表达的影响, 筛选实验最适的草酸钙浓度。将HK-2细胞分为4组:①对照组, 细胞贴壁后用正常培养基培养12 h, 然后继续用正常培养基;②左卡尼汀组, 细胞贴壁后用含5 mmol/L左卡尼汀的培养基预处理12 h, 然后更换为含有5 mmol/L左卡尼汀的培养基;③草酸钙组, 细胞贴壁后用正常培养基培养12 h, 然后更换为含有最适浓度草酸钙的培养基;④草酸钙+左卡尼汀组, 细胞贴壁后用含5 mmol/L左卡尼汀的培养基预处理12 h, 然后更换为含有5 mmol/L左卡尼汀和最适浓度草酸钙的培养基。4组更换培养基后继续培养24 h, 收集细胞或上清液, 采用蛋白质印迹法检测铁死亡相关蛋白醌氧化还原酶(NQO1)、ACSL4、XCT、GPX4蛋白表达水平。采用相应试剂盒分别检测超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽(GSH)、丙二醛水平;活性氧试剂盒检测细胞活性氧水平;二价铁离子探针检测细胞内铁离子蓄积情况。采用乳酸脱氢酶(LDH)试剂盒检测细胞损伤程度。采用透射电镜观察线粒体损伤情况。对细胞行DAPI染色观察细胞核损伤情况;行苏木素染色观察草酸钙晶体黏附情况。结果蛋白质印迹法检测结果显示, 0、2、4、8 mmol/L草酸钙组的ACSL4蛋白表达分别为0.37±0.16、0.68±0.16、0.73±0.09、0.89±0.03, XCT蛋白表达分别为1.11±0.10、0.91±0.14、0.83±0.09、0.80±0.07, GPX4蛋白表达分别为1.23±0.13、0.99±0.17、0.81±0.05、0.72±0.06, 与0 mmol/L组相比, 2、4、8 mmol/L组ACSL4蛋白表达升高, XCT、GPX4蛋白表达降低, 差异均有统计学意义(P<0.05), 其中4 mmol/L组与0 mmol/L组比较差异更显著(P<0.01), 故将4 mmol/L作为最适浓度进行后续实验。对照组、左卡尼汀组、草酸钙组、草酸钙+左卡尼汀组的NQO1水平分别为0.36±0.06、0.54±0.05、0.76±0.07、0.90±0.03, 左卡尼汀组与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05), 草酸钙组与对照组比较差异有统计学意义(P<0.01), 草酸钙+左卡尼汀组与草酸钙组比较差异有统计学意义(P<0.05);ACSL4水平分别为0.66±0.10、0.58±0.08、0.99±0.03、0.77±0.09, XCT水平分别为0.93±0.08、0.85±0.07、0.76±0.06、0.99±0.05, GPX4水平分别为1.10±0.09、1.09±0.09、0.85±0.03、0.99±0.02, 左卡尼汀组与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05), 草酸钙组与对照组比较差异有统计学意义(P<0.01), 草酸钙+左卡尼汀组与草酸钙组比较差异有统计学意义(P<0.05)。对照组、左卡尼汀组、草酸钙组、草酸钙+左卡尼汀组SOD水平分别为(100.00±5.79)%、(105.80±3.26)%、(44.74±7.60)%、(85.01±5.15)%, GSH水平分别为(100.00±4.73)%、(107.10±5.48)%、(53.49±3.98)%、(81.18±5.48)%, 丙二醛水平分别为(100.00±2.36)%、(98.00±11.10)%、(129.11±2.59)%、(113.35±5.79)%, 左卡尼汀组与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05), 草酸钙组与对照组比较差异有统计学意义(P<0.01), 草酸钙+左卡尼汀组与草酸钙组比较差异有统计学意义(P<0.05)。对照组、草酸钙组、草酸钙+左卡尼汀组活性氧荧光强度分别为(63.98±9.41)AU、(145.41±8.39)AU、(85.37±4.51)AU, 亚铁离子荧光强度分别为(39.77±0.68)AU、(68.40±3.14)AU、(48.60±4.30)AU, 草酸钙组与对照组比较差异有统计学意义(P<0.01), 草酸钙+左卡尼汀组与草酸钙组比较差异有统计学意义(P<0.01)。对照组、左卡尼汀组、草酸钙组、草酸钙+左卡尼汀组LDH水平分别为(100.00±5.37)%、(99.50±6.38)%、(153.77±6.06)%、(132.50±5.58)%, 左卡尼汀组与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05), 草酸钙组与对照组比较差异有统计学意义(P<0.01), 草酸钙+左卡尼汀组与草酸钙组比较差异有统计学意义(P<0.05)。透射电镜检查结果显示, 相较于对照组, 草酸钙组的线粒体皱缩, 嵴断裂或消失, 可见明显的双层膜结构;相较于草酸钙组, 草酸钙+左卡尼汀组线粒体皱缩情况减轻, 嵴相对增多, 个别可见双层膜结构。DAPI染色结果显示, 相较于对照组, 草酸钙组部分细胞核损伤明显加重;相较于草酸钙组, 草酸钙+左卡尼汀组细胞核损伤明显减轻。晶体黏附实验结果显示, 相较于对照组, 草酸钙组草酸钙晶体呈黑色颗粒状黏附于细胞, 汇聚成团;相较于草酸钙组, 草酸钙+左卡尼汀组黑色颗粒黏附于细胞的情况明显减轻。结论左卡尼汀能够减轻草酸钙诱导HK-2细胞的氧化应激和铁死亡, 从而减轻细胞损伤和晶体黏附。
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