基于CRISPR/Cas9方法构建‘沪农灵芝1号’基因编辑系统

作者：张志刚; 张劲松; 邹根; 唐传红; 冯杰; 鲍大鹏; 陈建波; 谭贻

来源：食用菌学报, 2023, 30(02): 9-18.

DOI：10.16488/j.cnki.1005-9873.2023.02.002

• ‘沪农灵芝1号’
• 基因破坏
• 成簇的规律间隔的短回文重复序列及其相关蛋白9(CRISPR/Cas9)
• 曲拉通X-100

构建密码子优化的cas 9表达质粒pMD-EXP-cas 9，通过聚乙二醇（polyethylene glycol,PEG）介导转化灵芝（Ganoderma lucidum）菌株‘沪农灵芝1号’（‘Hunong No.1’）单核菌株L1，得到含有cas9完整表达盒的菌株L1-cas9。利用T7启动子构建靶向ura3基因的表达质粒psgRNA-1和psgRNA-2，体外转录后得到sgRNA 1和sgRNA 2。通过PEG介导的转化，将sgRNA 1和sgRNA 2转化进L1-cas9的原生质体中，得到ura3基因被破坏的突变体，首次在‘沪农灵芝1号’菌株单核体中构建成簇的规律间隔的短回文重复序列及其相关蛋白9(clustered regularly interspaced short palindromic repeat/CRISPR-associated protein 9, CRISPR/Cas9)基因编辑系统，ura3基因的编辑效率为4个突变体（107个原生质体）。利用0.006%曲拉通X-100优化PEG介导的转化系统，可使ura3基因编辑效率提高至18个以上突变体（107个原生质体），本研究的结果为灵芝基因功能的研究和分子育种提供更高效的方法。

• 单位
  上海市农业科学院食用菌研究所; 上海师范大学; 生命科学学院