新型Tet-On反式激活因子对GDNF基因腺相关病毒载体表达调控的研究

作者：陈腾; 李新钢; 吴承远; 冈田尚己; 小泽敬也

来源：中华医学杂志, 2005, (06): 49-52.

• 反式作用因子
• 依赖病毒
• 神经生长因子类

目的　通过在胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)基因腺相关病毒(AAV)表达载体中插入改良的Tet On调控因子,达到有目的调节GDNF的表达,避免基因过度表达或重组可能对宿主产生的危害。方法　首先在pAAV- GDNFflag前病毒质粒的hHG部分插入寡核苷酸序列,通过含相应酶切位点的引物,聚合酶链反应(PCR)扩增反式激活因子rtTA_2s S_2和四环素反应元件 (TRE),并插入寡核苷酸序列,构建pAAV- rtTA_2s -S_2- TRE -GDNFflag。与辅助质粒共转染HEK293细胞完成重组腺相关病毒(rAAV)载体的包装,氯化铯梯度超速离心分离病毒裂解液,半透膜提纯病毒载体,实时定量PCR(RQ- PCR)检测病毒效价。rAAV感染HEK293细胞,荧光显色和Western印迹法检测rtTA_2s S_2的体外调控;rAAV感染Wistar小鼠腓肠肌,酶联免疫吸附实验 (ELISA)检测GDNF基因表达的体内调控。结果　体外实验强力霉素阳性组Western印迹可见明显GDNF条带,阴性组未见;体内实验强力霉素阳性组GDNF在 2周内表达 (32 .6pg/ml±2 .6pg/ml),高于强力霉素阴性组 ( 10 .1pg/ml±2 .4pg/ml),差异有统计学意义。结论　Tet -On反式激活因子rtTA_2s S_2、TRE和GDNF基因可构建在同一AAV载体,通过调节诱导剂强力霉素的浓度,rtTA2s -S2在体内和体外均能有效调控下游目的基因GDNF的表达。

• 单位
  自治医科大学; 山东大学齐鲁医院