磷酸钙盐沉淀法成功建立稳定的双质粒转染细胞模型

作者：马桢; 黄雄; 牛玉宏; 龚惠; 邹云增

来源：上海医学, 2013, 36(03): 229-232+170.

• 磷酸钙盐沉淀法
• 双转染
• 质粒
• 血管紧张素Ⅱ受体1型
• 钙/钙调蛋白依赖性激酶Ⅱ

目的建立表达血管紧张素Ⅱ受体1型(AT1)和钙/钙调蛋白依赖性激酶Ⅱ(CaMKⅡ)或CaMKⅡ的活性抑制体(DN)的双质粒转染COS7细胞模型,观察其磷酸化细胞外调节蛋白激酶(p-ERK)反应。方法通过扩增、筛选及抽提得到相关质粒,采用双酶切法及琼脂糖电泳鉴定目的DNA片段。采用磷酸盐钙沉淀法将质粒AT1和CaMKⅡ野生型(CaMKⅡ/WT)或CaMKⅡ/DN转入COS7细胞内,疫荧光法(IF)、免疫印迹法(WB)测定细胞表面表达的AT1(及其所带的HA-tag)、细胞质内表达的CaMKⅡ/WT或CaMKⅡ/DN(及其所带的V5-tag)。给予转染细胞以血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)、AT1受体拮抗剂(ARB)+AngⅡ等刺激,WB测定p-ERK改变。结果质粒酶切后电泳可见目的长度DNA片段。在转染细胞中,IF呈阳性荧光反应,WB可发现目的蛋白;而未转染细胞中则无。AngⅡ刺激引起转染AT1和CaMKⅡ/WT的细胞产生p-ERK升高反应,可为ARB预处理消除;而未转染细胞及转染AT1和CaMKⅡ/DN的细胞无类似反应。结论磷酸钙盐沉淀法可成功建立该双转染细胞模型。

• 单位
  复旦大学附属中山医院青浦分院