罗非鱼2种常见病毒双重RT-PCR检测方法的建立

作者：徐淑菲; 曾韵颖; 朱黄鑫^*; 刘启霖; 方成俊; 孔凡德; 蔡绍鑫; 林双庆

来源：经济动物学报, 2023, 27(03): 182-188.

DOI：10.13326/j.jea.2023.1659

• 罗湖病毒
• 病毒性神经坏死病毒
• 特异性引物
• dRT-PCR

根据罗湖病毒（Tilapia lake virus,TiLV）编码RNA聚合酶片段1和病毒性神经坏死病毒（Nervous necrosis virus,NNV）编码衣壳蛋白的基因片段，设计2组特异性引物，建立同时检测TiLV和NNV的双重RTPCR(duplex reverse transcription polymerase chain reaction,dRT-PCR)检测方法，并对建立的方法进行反应体系和条件优化。结果表明：dRT-PCR方法的25μL优化反应体系为2×One-Step Reaction Solution B 12.5μL,One-Step Enzyme Mix 1μL,NNV F (20μmol/L) 0.5μL,NNV R (20μmol/L) 0.5μL,TiLV F (20μmol/L) 0.5μL,TiLV R (20μmol/L) 0.5μL，模板1为0.5μL，模板2为0.5μL，补充RNase-free water至总体积25μL。优化反应条件为50℃30 min,94℃2 min;94℃30 s,56℃30 s,72℃1 min,30个循环；72℃延伸5 min。灵敏度均为1×10-5 ng/μL，特异性好。该方法可同时检测罗非鱼2种常见病毒TiLV和NNV，也可单独检测TiLV或NNV，为TiLV、NNV的监测和预防提供技术支撑。