高山被孢霉中Δ9脂肪酸脱饱和酶的表达、纯化和其细胞色素b5功能域的鉴定

作者：王明轩; 陈海琴; 顾震南; 陈卫; 陈永泉

来源：中国生物工程杂志, 2017, 37(03): 43-50.

DOI：10.13523/j.cb.20170306

• 脂肪酸脱饱和酶
• 膜结合蛋白质
• 蛋白质纯化
• 高山被孢霉
• 细胞色素b5功能域

在毕赤酵母中表达和纯化源自高山被孢霉ATCC 32222的膜结合Δ9-I脂肪酸脱饱和酶,测定其活性,并探究其细胞色素b5功能域的性质。构建含有高效纯化标签ZZ-tag的表达载体;用Western blotting和SDS-PAGE筛选Δ9-I脂肪酸脱饱和酶高表达量转化子;通过梯度离心和去垢剂筛选确定膜蛋白质提取条件;采用IgG亲和纯化色谱和阴离子交换色谱对Δ9-I脂肪酸脱饱和酶进行纯化;利用酿酒酵母细胞破碎物为底物考察Δ9-I脂肪酸脱饱和酶活性;通过波长扫描和Na2S2O4还原实验对Δ9-I脂肪酸脱饱和酶细胞色素b5功能域进行表征。结果显示,目的蛋白质被成功表达并筛选出高表达量转化子;20 000g离心1h为最佳膜分离条件,Fos-Choline-16为最佳去垢剂;纯化后的Δ9-I脂肪酸脱饱和酶结构完整,具有细胞色素b5功能域;在酿酒酵母提取物中Δ9-I脂肪酸脱饱和酶对C16:0和C18:0底物的转化效率分别为(16.88±9.32)%和(20.61±7.55)%;波长扫描显示Δ9-I脂肪酸脱饱和酶在411nm处有强吸收,并且在Na2S2O4作用下被还原至422nm,说明细胞色素b5功能域在体外能够被还原。因此,含有细胞色素b5功能域的脂肪酸脱饱和酶的首次成功表达、纯化和鉴定为亚铁血红素脂肪酸脱饱和酶脱饱和反应机制的研究奠定了基础。

• 单位
  江南大学; 食品科学与技术国家重点实验室