庆大霉素特异性单链DNA适配体的筛选、表征和应用

作者：巫朦朦; 韩旭艳; 蔡蓉凤; 李茂林^*; 田亚平; 周楠迪^*

来源：中国科学:生命科学 , 2019, 49(05): 637-648.

• 庆大霉素
• 指数富集的配体系统进化技术
• 适配体
• 亲和层析
• 金纳米粒子

庆大霉素是一种常用的氨基糖苷类抗生素,对细菌尤其是革兰氏阴性菌有显著的抑菌作用,但其本身具有较强的毒副作用,而不规范的使用会对环境和人体健康产生危害.因此,建立一种高灵敏的快速检测庆大霉素的方法对于加强食品市场监管和环境监控具有重要意义.本文利用基于Sepharose亲和层析的指数富集的配体系统进化技术,经过九轮筛选和克隆测序,从体外合成的全长为79个核苷酸的随机单链DNA文库中筛选得到34条与庆大霉素有亲和力的适配体序列.通过同源性分析将这些序列分为6个家族,利用Mfold软件分析这些序列的二级结构及其稳定性,从中选出结构稳定性最高的序列进行解离常数(Kd)测定,最后得到一条与庆大霉素具有极高亲和力的适配体Ap-26,其解离常数(Kd)为14.00±3.34 nmol/L.通过Autodock 4.0软件对Ap-26与庆大霉素进行分子对接模拟,结果表明Ap-26与庆大霉素主要的结合位点是17～20, 54～56位核苷酸.在此基础上,利用适配体Ap-26为识别元件构建了基于金纳米粒子(gold nanoparticles, AuNPs)比色检测庆大霉素的方法,验证了该适配体的应用潜力.当庆大霉素的浓度在50～700 nmol/L范围内时, AuNPs溶液在520 nm处的吸光值与庆大霉素的浓度存在良好的线性关系,检测限为11.50 nmol/L.将该方法应用于牛奶样品中庆大霉素的检测时发现牛奶基质成分对检测结果的影响很小,庆大霉素的回收率均超过90%.以上结果表明本文筛选得到的庆大霉素适配体能有效应用于庆大霉素检测方法的构建.

• 单位
  江南大学; 生物工程学院; 宜兴市肿瘤医院